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目的:奶牛乳腺炎是影响奶牛养殖场日常经营管理的常见传染性疾病,其发生、发展主要受病原微生物及宿主遗传因素的影响;其中,无乳链球菌作为重要的环境性病原微生物,在奶牛乳腺炎发生过程中发挥重要作用;而宿主遗传因素也影响其对无乳链球菌的易感程度。此前的研究在奶牛乳腺炎的流行病学和病原学上积累了丰富的成果,但在导致奶牛乳腺炎的无乳链球菌的病原学特征、与人源菌株的遗传关系及其与宿主免疫基因多态性的关联程度等方面仍可进一步研究发掘。因此,本研究拟全面、系统地分析我国奶牛养殖主要省区隐性乳腺炎中无乳链球菌的病原特征、流行菌株的基因组序列、与人源菌株的遗传进化关系及其宿主免疫基因(BOLA和CD14)多态性的关联,为奶牛无乳链球菌性乳腺炎的综合防治提供重要参考。方法:(1)采集海南、河南、辽宁、内蒙古、陕西、山西、山东、四川、新疆和浙江10省区21个奶牛养殖场奶样,开展隐性乳腺炎样本无乳链球菌的分离鉴定、荚膜血清分型、基因分型、毒力基因检测(hemolysin III,C-βprotein,C-αprotein,surface protein rib,hyaluronate lyase,CAMP factor,β-hemolysin/cytolysin,C5a peptidase)、和抗生素敏感性检测(红霉素、克林霉素、氨苄西林、头孢吡肟、万古霉素、左氧氟沙星、氯霉素),全面、系统阐明我国奶牛乳腺炎中无乳链球菌的流行病学特征。(2)使用二代测序(Illumina Novaseq)和三代测序(Pac Bio Sequel)平台对8株奶牛隐性乳腺炎无乳链球菌流行菌株进行基因组序列测定,组装拼接后使用生物信息学分析工具对获得的基因组序列进行注释与分析,揭示我国奶牛隐性乳腺炎中无乳链球菌的基因组序列特征。(3)以新疆医院为研究现场,从人源样本中分离鉴定无乳链球菌,开展荚膜血清型、基因型、毒力基因、药物敏感性检测;对流行菌株进行基因组序列测定和遗传进化分析,比较其与牛源菌株的差异。(4)采集牛奶和血液样本,开展奶牛隐性乳腺炎检测、阳性样本无乳链球菌的分离和奶牛BOLA和CD14基因多态性检测;分析隐性乳腺炎和无乳链球菌感染对日产奶量的影响,解析BOLA和CD14基因多态性位点与奶牛隐性乳腺炎和无乳链球菌易感性的关联程度。结果:(1)我国10省区21个奶牛养殖场采集的2225份牛奶样本,经LMT方法确定946份隐性乳腺炎奶样,阳性率为42.52%(95%CI 40.46%-44.57%)。从阳性样本中分离鉴定出133株无乳链球菌,平均分离率为14.06%(95%CI 11.94%-16.37%),新疆分离率最高,为21.68%(95%CI 16.90%-26.45%);浙江省分离率最低,仅为6.90%(95%CI 0.03%-13.41%)。经基因检测,流行荚膜血清型为Ia型、流行基因型为ST103,除保守毒力基因(hyaluronate lyase、CAMP factor、β-hemolysin)外,流行毒力基因为C-αprotein(16.54%,22/133)、surface protein(13.53%,18/133),毒力基因hemolysin III和C5a peptidase的检出率分别为2.26%和3.76%,未检出C-βprotein基因;临床药物敏感性检测显示,分离菌株对左氧氟沙星、头孢吡肟、氯霉素和氨苄西林耐药比例分别为63.91%、3.76%、2.26%和2.26%;发现1株万古霉素不敏感菌株、2株氨苄西林/头孢吡肟/左氧氟沙星和1株氨苄西林/头孢吡肟/左氧氟沙星/万古霉素多重耐药菌株,它们均为ST103型,分离自新疆和辽宁地区。(2)获得8株牛源无乳链球菌全基因组序列框架图,基因组大小为2.13-2.20Mb,编码2170-2237个基因序列,携带24-29个毒力基因,拥有tetracycline-resistant ribosomal protection protein、defensin resistant mpr F、ANT(6)、chloramphenicol acetyltransferase(CAT)、major facilitator superfamily(MFS)antibiotic efflux pump等5类耐药基因家族。(3)新疆医院分离的9株人源无乳链球菌荚膜血清型为Ia、Ib和III型、基因型为ST10、ST485、ST314、ST19和ST1168;对克林霉素、红霉素、左氧氟沙星和头孢吡肟的耐药(不敏感)数量分别为7株(77.78%)、3株(33.33%)、3株(33.33%)和1株(11.11%);经过全基因组测序,获得其中4株人源无乳链球菌框架图,基因组大小为2.01-2.16Mb,编码2105-2225个基因,携带24或35种毒力基因,拥有APH(3’)、ABCF ATP-binding cassette ribosomal protection protein、defensin resistant mpr F、Erm 23S ribosomal RNA methyltransferase、major facilitator superfamily(MFS)antibiotic efflux pump、ANT(6)、tetracycline-resistant ribosomal protection protein等7种耐药基因家族。(4)牛源和人源菌株存在不同的ST型;人源菌株携带hymolysin III和C-αprotein毒力基因比例显著高于牛源菌株,而hyaluronate lyase则显著低于后者(p<0.001);人源菌株对红霉素和克林霉素不敏感比例高于牛源菌株(p<0.001);人源菌株SA007与牛源菌株SA002、SA009、SA003、SA080、SA090、SA091和SA098处于同一进化分支;牛源菌株相比于人源菌株,不携带fbs A、lmb、pil A、pil B、pil C、srt C3和srt C4等7种毒力基因,未携带APH(3’)、ABC-F ATP-binding cassette ribosomal protection protein和Erm 23S ribosomal RNA methyltransferase等3种耐药基因家族。(5)奶牛隐性乳腺炎可造成产奶量下降3.65±1.09kg/天,占日产奶量12.15%±3.36%;无乳链球菌性奶牛隐性乳腺炎可造成奶牛产奶量下降5.62±1.56kg/天,占日产奶量18.71%±5.19;通过对BOLA和CD14基因多态性研究,发现BOLA(80C→G)、BOLA(93T→C)、BOLA(188C→G)、BOLA(191G→T)、BOLA(196A→G)、BOLA(209T→A)、BOLA(218C→G)、BOLA(219A→G)、BOLA(222A→G)、BOLA(233G→T)、BOLA(241C→G)、BOLA(243 T→G)、BOLA(244 A→T)、BOLA(245 C→G)、BOLA(266 T→G)、BOLA(267 T→C)、BOLA(268 A→G)、BOLA(269 T→G)、BOLA(270T→G)、CD14(g.528 A→C)、CD14(g.612 A→G)、CD14(g.1022 A→G)、CD14-3(g.285A→C)、CD14-6(g.161 A→G)、CD14-6(g.173 A→G)等25个突变位点,其中BOLA(218C→G)等位基因频率与奶牛感染无乳链球菌相关(p<0.05),能增加奶牛感染无乳链球菌的潜在风险(OR=2.343;95%CI 1.148-4.781)。结论:(1)我国奶牛主要养殖省区的奶牛养殖场隐性乳腺炎无乳链球菌的流行荚膜血清型为Ia型,流行基因型为ST103;除保守毒力基因外,菌株中流行毒力基因为C-αprotein和surface protein rib;对左氧氟沙星耐药率最高,发现1株对万古霉素不敏感的菌株、2株氨苄西林/头孢吡肟/左氧氟沙星和1株氨苄西林/头孢吡肟/左氧氟沙星/万古霉素多重耐药菌株。(2)人源无乳链球菌的荚膜血清型为Ia、Ib和III型,基因型为ST10、ST485、ST314、ST19和ST1168,对克林霉素、红霉素和左氧氟沙星耐药(不敏感)比例较高。(3)获得8株牛源和4株人源无乳链球菌的基因组框架图,两者在荚膜血清型、毒力基因、耐药基因等方面均存在差异。(4)奶牛BOLA(218C→G)位点与奶牛感染无乳链球菌性隐性乳腺炎有关,能增加奶牛感染无乳链球菌的潜在风险。