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目的本实验主要研究叶酸(Folic acid)对体外培养神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化方向的影响,探讨叶酸基于DNA甲基化途径调控NSCs分化的机制。为NSCs移植和定向分化提供科学依据。方法采用无血清细胞培养法,培养新生大鼠海马NSCs,用SOX2和BrdU免疫荧光双标鉴定,并将NSCs分为5组：①对照组(folic acid-free differentiation medium, Control),②低叶酸组(low folic acid,8μg/mL, FA-L),③高叶酸组(high folic acid,32μg/mL, FA-H),④低叶酸加甲基阻断剂组(8μg/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAL-Z),⑤高叶酸加甲基阻断剂组(32μg/mL folic acid and150nmol/mL zebularine, FAH-Z)。在分化第1天加甲基阻断剂作用,48h后换正常培养液,收集分化第6天细胞。分别采用免疫荧光(Immunofluorescent, IF)和免疫印迹(Western Blot)检测神经元的特异性标志物β-tubulin Ⅲ和星形胶质细胞的特异性标志物GFAP的表达；采用DNA甲基化定量试剂盒检测不同叶酸浓度下细胞总甲基化水平；甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性,Western Blot检测DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的蛋白表达；用高效液相法(HPLC)检测细胞内S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine, SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine, SAH)的水平；Western Blot检测JAK-STAT通路中信号转导和转录激活因子STAT(Signal transducers and activators of transcription, STAT)中STAT1和STAT3的磷酸化水平；采用MeDIP-qPCR(甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR)检测GFAP基因启动子的甲基化水平。结果采用无血清培养法体外细胞培养6d后,细胞聚集成球形团块,边缘发亮,折光性强,呈悬浮状态,经SOX2和BrdU免疫荧光双标记法鉴定呈双阳性。体外诱导分化后,免疫荧光标记和Western Blot检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组的β-tubulin Ⅲ阳性表达率均增加,GFAP的阳性表达率均减少,低叶酸加甲基阻断剂组和高叶酸加甲基阻断剂组β-tubulin Ⅲ阳性表达率均减少,GFAP的阳性表达率均增加,差异均有统计学意义(P<0.05)；低叶酸加甲基阻断剂组与低叶酸组相比,低叶酸加甲基阻断剂组β-tubulin Ⅲ阳性表达率下降,GFAP阳性表达率增加,差异均有统计学意义(P<0.05)；高叶酸加甲基阻断剂组与高叶酸组相比,高叶酸加甲基阻断剂组P-tubulin III阳性表达率下降,GFAP阳性表达率增加,差异均有统计学意义(P<0.05)o DNA,总甲基化水平检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组细胞总甲基化水平均增加,且高叶酸组总甲基化水平高于低叶酸组,差异均有统计学意义(P<0.05)。DNMTs总活性检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组的DNMTs总活性均增强,低叶酸加甲基阻断剂组和高叶酸加甲基阻断剂组的DNMTs总活性均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)；低叶酸加甲基阻断剂组与低叶酸组相比,低叶酸加甲基阻断剂组DNMTs总活性显著降低,高叶酸加甲基阻断剂组与高叶酸组相比,高叶酸加甲基阻断剂组DNMTs总活性下降,且高叶酸加甲基阻断剂组DNMTs总活性高于低叶酸加甲基阻断剂组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测DNMTs的蛋白表达,结果显示：与对照组相比,DNMT1和DNMT3a的蛋白表达在低叶酸组和高叶酸组均增加,DNMT3b的蛋白表达仅在高叶酸组增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。HPLC检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组的SAM水平升高,SAH的水平降低,SAM/SAH的比值增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测p-STAT1, p-STAT3表达,结果显示：与对照组相比,高叶酸组p-STAT3的表达下降,差异有统计学意义(P<0.05); p-STAT1在各组中的表达无显著改变,差异无统计学意义(P>0.05)。MeDIP-qPCR检测结果显示：与对照组相比,低叶酸组和高叶酸组GFAP基因启动子甲基化水平升高,且高叶酸组高于低叶酸组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论本实验结果显示,叶酸减少体外神经干细胞向神经胶质方向分化,进而增加向神经元方向分化比例。其可能的机制是：叶酸通过增加DNMT1, DNMT3a/3b蛋白的表达提高DNMTs总活性水平,通过改变甲基化途径中关键代谢物SAM和SAH浓度,促进甲基化反应的发生,提高星形胶质细胞GFAP基因启动子的甲基化水平,同时降低p-STAT3的表达,协同抑制NSCs向星形胶质细胞的分化,从而提高神经元的分化比例。