自噬相关基因和水通道蛋白基因在杨树应对高盐及干旱胁迫中的功能分析

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在植物生长的整个生命周期中,经常会面临来自多种环境因子引起的逆境胁迫,如:高盐胁迫、干旱胁迫等。这些外界条件阻碍了植物生长发育,给农林业生产带来了严重的损失。因此,揭示植物的抗逆机制,培育抗逆性强的植株对农林业生产有重要意义。为应对环境引起的胁迫所带来的损害,植物体内形成了一系列适应性机制例如:降解受损伤的蛋白质和细胞器、降低蒸腾等。细胞自噬过程和水通道蛋白,在植物响应非生物胁迫过程中起了非常关键的作用。杨树作为一个木本模式植物,虽然已经被广泛地应用于胁迫响应的研究。但是,其在自噬过程以及水通道蛋白参与的H2O2转运机制在抗盐以及抗旱中的响应机制目前还不清楚。本研究以杨树自噬通路相关基因ATG(autophagy-associated genes)、Pag NBR1(neighbor of BRCA1)以及水通道蛋白编码基因Pag PIP2;10(plasma membrane intrinsic proteins)为研究对象。在全基因组上鉴定自噬相关基因,并且构建Pag ATG18a、Pag NBR1以及Pag PIP2;10的杨树超表达株系,分析了其参与杨树响应盐胁迫和干旱胁迫中的机制,主要结论如下:(1)在杨树基因组中鉴定出49 ATG基因,分布在19条染色体上。基因结构分析表明,各亚家族之间外显子和内含子数量相似。组织表达分析发现,各亚家族在根木质部、成熟叶、伸展叶以及种子和花絮中表达呈现显著差异。ABA和BR处理诱导ATG18亚家族成员较其他亚家族成员表达量更高。盐胁迫处理后ATG18亚家族各成员中ATG18a表达量最高。(2)杨树ATG18a(Pag ATG18a)基因在叶片中表达相对较高。瞬时转化杨树叶片细胞后发现,Pag ATG18a蛋白锚定于细胞质和细胞核中。盐胁迫处理Pag ATG18a的过表达株系发现,Pag ATG18a能够显著提高杨树的耐盐性。在盐胁迫下,转基因株系维持了更高的叶片含水量以及光合作用。此外,Pag ATG18a转基因株系在盐胁迫以后,抗氧化酶SOD、POD、CAT活性增加,减少了膜的氧化损伤。(3)过表达Pag NBR1显著增强了杨树的耐盐性。与野生型(WT)相比,转基因植株在盐胁迫下表现出更高的抗氧化酶活性、更少的活性氧(ROS)和更高的净光合速率。此外,共定位和酵母双杂交分析显示Pag NBR1定位于自噬小体,并能与自噬相关蛋白ATG8相互作用。与WT相比,转Pag NBR1基因的杨树在盐胁迫下ATG8表达量更高,并且形成了更多的自噬体泡,促进了不溶性蛋白和不溶性泛素化蛋白积累减少。在野生型和转基因系中,自噬抑制剂Con A处理后不溶性蛋白和不溶性泛素化蛋白的积累情况相似。总之,Pag NBR1是杨树中一种重要的选择性自噬受体,通过促进抗氧化系统活性和自噬活性而赋予其更强的耐盐性。(4)Pag PIP2;10基因受到脱水胁迫诱导表达,且其编码的蛋白主要定位于细胞膜上。在杨树中过量表达Pag PIP2;10增加了对干旱胁迫的忍耐性。干旱胁迫下,Pag PIP2;10促进了过表达株系的气孔的关闭,降低了蒸腾作用,是过表达株系保持了较高的含水量。进一步分析发现,外源ABA处理后的Pag PIP2;10过表达株系叶片的保卫细胞中ROS积累增多。除此之外,Pag PIP2;10ox株系的根系水力导度均高于野生型。总之,Pag PIP2;10通过增强干旱胁迫下的叶片保水能力与根系导水性,对增强干旱胁迫的抵御起到了积极的作用。综上所述,本研究对杨树中自噬相关基因Pag ATG、Pag NBR1以及水通道蛋白编码基因PIP2;10的鉴定及功能机制研究表明,胁迫条件能够诱导Pag ATG、NBR1以及Pag PIP2;10的上调表达。超表达Pag ATG18a、Pag NBR1通过增强了植物的抗氧化性以及自噬过程,增加了杨树对盐胁迫的耐受性。超表达Pag PIP2;10促进了干旱胁迫下ROS在保卫细胞中的积累,进而促进了气孔的关闭,增强了杨树对干旱胁迫的耐受性。本研究为杨树抗逆分子育种提供了基因资源以及理论基础。
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