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在植物生长的整个生命周期中,经常会面临来自多种环境因子引起的逆境胁迫,如:高盐胁迫、干旱胁迫等。这些外界条件阻碍了植物生长发育,给农林业生产带来了严重的损失。因此,揭示植物的抗逆机制,培育抗逆性强的植株对农林业生产有重要意义。为应对环境引起的胁迫所带来的损害,植物体内形成了一系列适应性机制例如:降解受损伤的蛋白质和细胞器、降低蒸腾等。细胞自噬过程和水通道蛋白,在植物响应非生物胁迫过程中起了非常关键的作用。杨树作为一个木本模式植物,虽然已经被广泛地应用于胁迫响应的研究。但是,其在自噬过程以及水通道蛋白参与的H2O2转运机制在抗盐以及抗旱中的响应机制目前还不清楚。本研究以杨树自噬通路相关基因ATG(autophagy-associated genes)、Pag NBR1(neighbor of BRCA1)以及水通道蛋白编码基因Pag PIP2;10(plasma membrane intrinsic proteins)为研究对象。在全基因组上鉴定自噬相关基因,并且构建Pag ATG18a、Pag NBR1以及Pag PIP2;10的杨树超表达株系,分析了其参与杨树响应盐胁迫和干旱胁迫中的机制,主要结论如下:(1)在杨树基因组中鉴定出49 ATG基因,分布在19条染色体上。基因结构分析表明,各亚家族之间外显子和内含子数量相似。组织表达分析发现,各亚家族在根木质部、成熟叶、伸展叶以及种子和花絮中表达呈现显著差异。ABA和BR处理诱导ATG18亚家族成员较其他亚家族成员表达量更高。盐胁迫处理后ATG18亚家族各成员中ATG18a表达量最高。(2)杨树ATG18a(Pag ATG18a)基因在叶片中表达相对较高。瞬时转化杨树叶片细胞后发现,Pag ATG18a蛋白锚定于细胞质和细胞核中。盐胁迫处理Pag ATG18a的过表达株系发现,Pag ATG18a能够显著提高杨树的耐盐性。在盐胁迫下,转基因株系维持了更高的叶片含水量以及光合作用。此外,Pag ATG18a转基因株系在盐胁迫以后,抗氧化酶SOD、POD、CAT活性增加,减少了膜的氧化损伤。(3)过表达Pag NBR1显著增强了杨树的耐盐性。与野生型(WT)相比,转基因植株在盐胁迫下表现出更高的抗氧化酶活性、更少的活性氧(ROS)和更高的净光合速率。此外,共定位和酵母双杂交分析显示Pag NBR1定位于自噬小体,并能与自噬相关蛋白ATG8相互作用。与WT相比,转Pag NBR1基因的杨树在盐胁迫下ATG8表达量更高,并且形成了更多的自噬体泡,促进了不溶性蛋白和不溶性泛素化蛋白积累减少。在野生型和转基因系中,自噬抑制剂Con A处理后不溶性蛋白和不溶性泛素化蛋白的积累情况相似。总之,Pag NBR1是杨树中一种重要的选择性自噬受体,通过促进抗氧化系统活性和自噬活性而赋予其更强的耐盐性。(4)Pag PIP2;10基因受到脱水胁迫诱导表达,且其编码的蛋白主要定位于细胞膜上。在杨树中过量表达Pag PIP2;10增加了对干旱胁迫的忍耐性。干旱胁迫下,Pag PIP2;10促进了过表达株系的气孔的关闭,降低了蒸腾作用,是过表达株系保持了较高的含水量。进一步分析发现,外源ABA处理后的Pag PIP2;10过表达株系叶片的保卫细胞中ROS积累增多。除此之外,Pag PIP2;10ox株系的根系水力导度均高于野生型。总之,Pag PIP2;10通过增强干旱胁迫下的叶片保水能力与根系导水性,对增强干旱胁迫的抵御起到了积极的作用。综上所述,本研究对杨树中自噬相关基因Pag ATG、Pag NBR1以及水通道蛋白编码基因PIP2;10的鉴定及功能机制研究表明,胁迫条件能够诱导Pag ATG、NBR1以及Pag PIP2;10的上调表达。超表达Pag ATG18a、Pag NBR1通过增强了植物的抗氧化性以及自噬过程,增加了杨树对盐胁迫的耐受性。超表达Pag PIP2;10促进了干旱胁迫下ROS在保卫细胞中的积累,进而促进了气孔的关闭,增强了杨树对干旱胁迫的耐受性。本研究为杨树抗逆分子育种提供了基因资源以及理论基础。