哮喘是一种严重的呼吸系统疾病。在哮喘中不仅存在气道炎症，并且还存在气道组织的重塑（airway remoldeling）。在气道重塑中，气道壁增厚，上皮下纤维化，成肌纤维细胞（myofibroblasts，MF）和平滑肌细胞﹙airway Smooth muscle cell，ASMC﹚过度增生。气道成纤维细胞不仅是气道的结构细胞，其在气道组织中的增值、迁移与分化等行为与气道重塑的发展过程密切相关。已有研究表明，在转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的诱导下，气道成纤维细胞可以向成肌纤维细胞分化。成肌纤维细胞的超微结构介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间，并且也表达平滑肌细胞的特征性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），有人推测成肌纤维细胞是成纤维细胞向平滑肌细胞转分化的过度形态。此外，在气道重塑中，由于成肌纤维细胞过度合成和分泌细胞外基质（excellular matrix，ECM）蛋白，从而导致细胞外基底膜增厚和基底硬度增加。然而，细胞外基底硬度的增加能否影响气道成纤维细胞的增殖、迁移等生物学行为，能否影响炎症因子TGF-β1诱导下的气道成纤维细胞向成肌纤维细胞的分化以及分化细胞的力学行为，从而加重哮喘的发病，至今并未被研究过。　　为了研究这个问题，本课题以SD（Sprague Dawley）大鼠气道成纤维细胞作为实验载体。首先，人工合成不同硬度的PDMS（Polydimethylsiloxane，PDMS）基底，杨氏模量分别1kPa、10 kPa、50 kPa；其次，原代培养和鉴定大鼠气道成纤维细胞。然后，将大鼠气道成纤维细胞接种在不同硬度的基底上，测量基底硬度对气道成纤维细胞形态、黏着斑、增殖和迁移等生物学行为的影响。最后，将大鼠气道成纤维细胞接种在不同硬度的基底上，并用10 ng/mL的TGF-β1诱导其向成肌纤维细胞分化。测量基底硬度对TGF-β1诱导的气道成纤维细胞向成肌纤维细胞分化的影响以及分化细胞力学行为的影响。本文的主要研究内容和结果如下：　　①基底硬度对气道成纤维细胞形态、黏着斑、增殖与迁移等生物学行为的影响：用相差显微镜观察并记录基底硬度对气道成纤维细胞粘附形态的影响；免疫荧光法检测基底硬度对气道成纤维细胞黏着斑（vinculin）的影响；细胞计数法测量不同硬度基底上气道成纤维细胞的生长曲线；MTT法检测基底硬度对气道成纤维细胞增殖活力的影响；划痕法检测基底硬度对气道成纤维细胞迁移的影响。研究发现，基底硬度对气道成纤维细胞的生物学行为有重要影响。首先，不同硬度基底上的气道成纤维细胞的粘附形态明显不同。基底硬度越高，气道成纤维细胞的铺展面积越大、细胞长短径比值越高；其次，免疫荧光检测结果显示，基底硬度对气道成纤维细胞黏着斑（vinculin）的形成有影响作用，基底硬度越高，黏着斑（vinculin）的大小越大；然后，不同硬度基底上的气道成纤维细胞的生长曲线显示，在细胞未长至融合状态时，基底硬度越高，气道成纤维细胞的生长速度越快；另外，MTT试验的结果表明，将气道成纤维细胞接种于不同硬度基底上24 h、48 h和72 h后，细胞的OD值均有极显著性差异（P<0.01），基底硬度越高，气道成纤维细胞的增殖活力越高；最后，划痕法测量细胞迁移的结果表明，将不同硬度基底上的成纤维细胞划痕处理12 h、24 h后，细胞的迁移率也具有极显著性差异（P<0.01），细胞外基底硬度越高，气道成纤维细胞的迁移能力越强。　　②基底硬度对TGF-β1诱导的气道成纤维细胞向成肌纤维细胞分化的影响：用PR-PCR法测量基底硬度对分化的细胞中α-SMA和I型胶原（collagen I）mRNA表达的影响；酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测基底硬度对分化过程中细胞分泌到胞外基质中 collagen I蛋白表达的影响；Western blot检测基底硬度对分化的细胞中α-SMA蛋白表达的影响。研究发现，基底硬度能促进气道成纤维细胞向成肌纤维细胞的分化。首先，PR-PCR的结果表明，和硬度为1 kPa基底上分化的细胞相比，硬度为10 kPa基底上分化的细胞的α-SMA和collagen I mRNA的表达量分别增加了0.14和0.32倍。而在硬度为50 kPa的基底上分化的细胞的α-SMA和collagen I mRNA的表达量分别增加了0.72（P<0.05）和0.64（P<0.05）倍；其次，ELISA的结果显示，和硬度为1 kPa的基底上分化的细胞相比，硬度为10 kPa和50 kPa的基底上分化的细胞分泌到细胞外基质中的collagen I蛋白的表达量分别增加了0.03倍（P<0.05）和0.2倍（P<0.01）。说明，基底硬度越高，细胞在分化过程中分泌到细胞外基质中的collagen I的蛋白量也越高；另外，Western blot检测结果显示，和硬度为1 kPa的基底上分化的细胞相比，硬度为10 kPa和50 kPa的基底上分化的细胞的α-SMA蛋白的表达量分别增加了0.43倍（P<0.05）和1.02倍（P<0.01）。这说明，基底硬度越高，分化的细胞表达收缩蛋白α-SMA的量也越高。　　③基底硬度对 TGF-β1诱导的气道成纤维细胞向成肌纤维细胞细胞分化过程中细胞力学行为的影响：利用磁微粒扭转细胞测量术（optical magnetic twisting cytometry，OMTC）测量基底硬度对分化的细胞的硬度和收缩反应的影响。OMTC的测量结果显示，所有分化的细胞都呈典型的幂率响应行为：细胞的硬度（G’）随着测量频率（f）的升高而增大，并且两者呈指数关系，G’（f）~fα，α为拟合直线的斜率。而且，基底硬度越高，细胞的硬度也越大。幂率指数α，随着硬度增加，从0.102增加到0.122；另外，测量结果显示，基底硬度越高，分化的细胞的收缩反应也越大。和硬度为1 kPa的基底上分化的细胞相比，硬度为50 kPa基底上分化的细胞的收缩反应明显增加（P<0.05）。　　因此，在气道重塑中，当细胞外基底硬度增加，首先影响气道成纤维细胞的形态、黏着斑、增殖与迁移。基底硬度越高，气道成纤维细胞的增殖与迁移速度越快，成纤维细胞增殖速度的增加使气道上皮下纤维化进一步加重。而气道成纤维细胞迁移速度的提高将可能导致气道的其他病变。有人推测能引起气道功能异常的气道平滑肌细胞是由气道成纤维细胞分化而来，气道成纤维细胞可能通过迁移到平滑基层并分化为平滑肌细胞，因此成纤维细胞迁移速度的提高将可能影响哮喘的病变速度。其次，在气道炎症因子TGF-β1的诱导下，细胞外基底硬度的增加，能促进气道成纤维细胞向成肌纤维细胞的分化以及影响分化细胞的力学行为，导致分化的细胞的收缩蛋白α-SMA合成和表达增加、collagen I等细胞外基质蛋白的合成和分泌增加、细胞硬度和细胞收缩反应提高。细胞硬度和收缩反应等力学行为的改变可能直接引起气道阻塞和气道高反应性的发生。而collagen I等细胞外基质蛋白合成和分泌的升高，将导致细胞外基质的进一步沉积和硬度增加。这对哮喘的发生和发展是一个恶性循环的过程。　　综上所述，本文从生物学和生物力学的角度探讨了细胞外基底硬度变化在气道重塑发生和发展中的作用，进一步加深了对哮喘和气道重塑病理机制的了解。气道组织的硬化程度不仅可能成为哮喘病诊断的重要依据，也有可能成为哮喘治疗的重要靶点。