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多糖作为自然界中的一类生物大分子,其来源丰富,具有良好的生物活性。通过硫酸化修饰后能获得与肝素类似的结构,可显著提高多糖的生物活性,如抗凝血、抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等功能。它作为一种新型药物具有多方面的优势,相关药物有的已经或者即将进入临床。本课题首次利用近似中性的三磺酸钠胺作为酯化试剂制备海藻酸钠硫酸酯,羧甲基纤维素硫酸酯和羟乙基纤维素硫酸酯,考察了反应过程中会影响实验结果的因素,从而得到最佳反应条件,并研究了所得三种多糖硫酸酯的生物活性,国内外未见相关报道,具有创新性。本论文具体研究内容如下:
1.采用三磺酸钠胺作为磺化试剂在水溶液中对海藻酸钠,羧甲基纤维素和羟乙基纤维素进行改性处理,制备海藻酸钠硫酸酯,羧甲基纤维素硫酸酯和羟乙基纤维素硫酸酯。通过单因素实验,以所得产物取代度为指标,考察了酯化剂溶液pH值、酯化剂用量、温度、时间对海藻酸钠,羧甲基纤维素和羟乙基纤维素磺化反应的影响。用硫酸钡-明胶分光光度法测定海藻酸钠硫酸酯,羧甲基纤维素硫酸酯和羟乙基纤维素硫酸酯的取代度。结果表明,磺化海藻酸钠的最佳反应条件为:酯化剂溶液pH=9,酯化剂摩尔量与海藻酸钠质量比为2/198mol/g,反应温度为40℃,反应时间为4h。磺化羧甲基纤维素的最佳反应条件为:酯化剂溶液pH=7,酯化剂摩尔量与羧甲基纤维素质量比为2.5/242mol/g,反应温度为45℃,反应时间为5h。磺化羟乙基纤维素的最佳反应条件为:酯化剂溶液pH=9,酯化剂摩尔量与羟乙基纤维素质量比为2.5/250mol/g,反应温度为60℃,反应时间为8h。用FTIR和13C-NMR表征了海藻酸钠硫酸酯,羧甲基纤维素硫酸酯和羟乙基纤维素硫酸酯的结构,用静态光散射法测定降解产物分子量。
2.研究了所制备的三种多糖硫酸酯的抗凝血活性。实验发现,三种多糖硫酸酯均有抗凝血活性。探讨了多糖衍生物的取代度、分子量以及浓度对其抗凝血活性的影响,产物的取代度越大、浓度越高,则其抗凝血活性越强,低分子量的多糖硫酸酯衍生物有利于延长凝血时间,因此,要得到较好的抗凝血活性,需选择一定的分子量范围。海藻酸钠硫酸酯的抗凝血活性优于羧甲基纤维素硫酸酯和羟乙基纤维素硫酸酯。
3.通过动物实验,研究了海藻酸钠硫酸酯对大鼠深Ⅱ度烧伤伤口愈合的影响。用5%海藻酸钠硫酸酯溶液处理的伤口在14d左右能完全愈合,并且无任何不良反应。病理学检查也证明经海藻酸钠硫酸酯处理过的伤口,其肉芽组织和上皮细胞的生长较快。海藻酸钠硫酸酯组伤口愈合时间明显快于对照组,结果表明,海藻酸钠硫酸酯对伤口愈合有促进作用。
4.通过细胞培养,研究了三种多糖硫酸酯对大鼠皮肤成纤维细胞的生长影响。三种多糖硫酸酯都能促进成纤维细胞的生长,随着多糖硫酸酯取代度的增加其促进作用也增强,当浓度为100ppm时,多糖硫酸酯促细胞生长作用最强,再升高细胞培养液的浓度,反而会抑制成纤维细胞的生长。用海藻酸钠硫酸酯作为培养液培养的大鼠成纤维细胞,其细胞密度最大,促成纤维细胞生长最为明显,促进作用优于羧甲基纤维素硫酸酯和羟乙基纤维素硫酸酯。