论文部分内容阅读
本文主要从以下几方面展开论述： 第一部分：消退素D1对小鼠呼吸机相关性肺损伤炎症反应的影响 目的：建立小鼠呼吸机相关性肺损伤模型，探讨消退素D1（RvD1）对呼吸机相关性性肺损伤的影响。 方法：SPF级雄性C57BL/6小鼠56只，6-8周龄，体重20-25g，随机分为七组（n=8）：（1）假手术组（Sham），进行所有手术操作，保留自主呼吸；（2）小潮气量机械通气组（LVT）：潮气量6ml/kg；（3）大潮气量机械通气组（HVT）：潮气量40ml/kg；（4）100ng RvD1干预组（RvD1（100））：潮气量40ml/kg，机械通气开始时腹腔注射RvD1100ng；（5）500ng RvD1干预组（RvD1（500））：潮气量40ml/kg，机械通气开始时腹腔注射RvD1500ng；（6）1000ng RvD1干预组（RvD1（1000））：潮气量20ml/kg，机械通气开始时腹腔注射RvD11000ng；（7）BOC-2加RvD1干预组（BOC+RvD1（500）），潮气量40ml/kg，机械通气开始前30min腹腔注射BOC-2（50μg/kg），机械通气开始时腹腔注射RvD1500ng。机械通气各组呼吸频率均为80次/分，机械通气时间均为4h。实验结束时查动脉血气分析，然后腹主动脉放血处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）和肺组织标本。光学显微镜下观察小鼠肺组织HE染色病理变化并进行肺损伤评分；测定小鼠肺组织湿/干重比(wet/dry weight ratio,W/D)；检测BALF中的总蛋白浓度；对BALF中细胞进行分类计数；ELISA法检测肺组织和BALF中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、IL-10和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattratctant protein-1，MCP-1）和RAGE的浓度。 结果：与Sham组比较，HVT组肺泡组织结构发生明显改变，肺损伤评分明显升高（P<0.05），动脉血氧分压（PaO2）明显降低（P<0.05），肺组织W/D比值明显升高（P<0.05），BALF中细胞总数、中性粒细胞计数、单核/巨噬细胞计数均明显增高（P<0.05），肺组织及BALF中TNF-α、IL-1β、IL-10、MCP-1和RAGE含量均明显增高（P<0.05）；RvD1（100）组各检测指标较HVT组无明显变化（P>0.05）；RvD1（500）组PaO2较HVT组明显升高（P<0.05），肺组织及BALF中IL-10较HVT组无明显变化（P>0.05），其它检测指标均较HVT组明显降低（P<0.05）；而RvD1（1000）组各检测指标与RvD1（500）组比较均无明显差异；BOC+RvD1（500）组PaO2较RvD1（500）组明显降低（P<0.05），肺组织及BALF中IL-10较RvD1（500）组无明显变化（P>0.05），其它检测指标均较RvD1（500）组明显升高（P<0.05）。 结论：RvD1（500ng）干预可以改善小鼠机械通气肺损伤时肺组织的病变程度，抑制中性粒细胞浸润，降低肺组织促炎介质的产生和渗出。RvD1可以减轻呼吸机相关性肺损伤时肺部的炎症反应，对小鼠呼吸机相关性肺损伤具有一定的保护。 第二部分：消退素D1对小鼠呼吸机相关性肺损伤PPAR-γ/NF-κB信号通路的影响 目的：探讨RvD1是否通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR-γ）和核因子-κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）信号通路，减轻小鼠呼吸机相关性肺损伤的炎症反应，发挥对肺损伤的保护作用。 方法：SPF级雄性C57BL/6小鼠32只，6-8周龄，体重20-25g,随机分成4组：（1）假手术组（Sham组），进行所有手术操作，保留自主呼吸；（2）大潮气量机械通气组（HVT组）：潮气量40ml/kg；（3）RvD1干预组（RvD1组）：潮气量40ml/kg，机械通气开始时腹腔注射RvD1500ng；（4）PPAR-γ拮抗剂组（GW9662+RvD1组）：机械通气开始前30min腹腔注射PPAR-γ拮抗剂GW9662（1mg/kg体重），机械通气开始时腹腔注射RvD1500ng。各组机械通气呼吸频率均为80次/分，机械通气时间均为4h。实验结束后腹主动脉放血处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）和肺组织标本。光学显微镜下观察小鼠肺组织HE染色病理变化并进行肺损伤评分；测定小鼠肺组织湿/干重比(wet/dry weight ratio,W/D)；ELISA法检测肺组织和BALF中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、IL-6、和RAGE的浓度。蛋白免疫印迹实验（Western Blot）法检测肺组织胞浆蛋白NF-κB抑制因子（inhibitor of kappaB,IκB-α）表达水平，肺组织胞核蛋白中NF-κB p65和PPAR-γ的表达水平。凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assays，EMSA）检测肺组织中NF-κB结合DNA的活性。 结果：与Sham组比较，HVT组肺泡组织结构发生明显改变，肺损伤评分明显升高（P<0.05），肺组织W/D比值明显升高（P<0.05），BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、和RAGE含量均明显增高（P<0.05）；肺组织胞浆蛋白中IκB-α蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，胞核蛋白中NF-κB p65表达明显升高(P<0.05)，PPAR-γ的表达明显降低(P<0.05)；与HVT组比较，RvD1组肺损伤评分明显降低（P<0.05），肺组织W/D比值明显减小（P<0.05），BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、和RAGE含量均明显下降（P<0.05）；肺组织胞浆蛋白中IκB-α蛋白表达水平明显升高（P<0.05），胞核蛋白中NF-κB p65表达明显下降（P<0.05），PPAR-γ的表达表达水平明显升高（P<0.05）；与RvD1组比较，GW9662+RvD1组肺损伤评分明显升高（P<0.05），肺组织W/D比值明显升高（P<0.05），BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6、和RAGE含量均明显增高（P<0.05）；肺组织胞浆蛋白中IκB-α蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，胞核蛋白中NF-κB p65表达明显升高(P<0.05)，PPAR-γ的表达显著降低(P<0.05)。 结论：RvD1改善了呼吸机相关性肺损伤时炎症反应，并增强了胞浆蛋白中IκB-α和胞核蛋白PPAR-γ的表达，抑制NF-κB核转位，降低了NF-κB的DNA结合活性。说明RvD1对机械通气肺损伤的保护作用至少部分是通过激活PPAR-γ进而抑制NF-κB信号转导通路实现的。 第三部分：消退素D1对小鼠呼吸机相关性肺损伤时血红素加氧酶-1表达的影响 目的：探讨RvD1对小鼠呼吸机相关性肺损伤中血红素加氧酶-1（HO-1）表达的影响及其相关作用机制。 方法：SPF级雄性C57BL/6小鼠32只，6-8周龄，体重20-25g,随机分成4组（n=8）：（1）假手术组（Sham组），进行所有手术操作，保留自主呼吸；（2）大潮气量机械通气组（HVT组）：潮气量40ml/kg；（3）RvD1干预组（RvD1组）：潮气量40ml/kg，机械通气开始时腹腔注射RvD1500ng；（4）HO-1拮抗剂锌原卟啉+消退素D1组（ZnPP+RvD1组）机械通气开始前30min腹腔注射HO-1拮抗剂ZnPP（10mg/kg），其余处理同RvD1组。各组机械通气呼吸频率均为80次/分，机械通气时间均为4h。实验结束后腹主动脉放血处死小鼠，收集支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）和肺组织标本。光学显微镜下观察小鼠肺组织HE染色病理变化并进行肺损伤评分；ELISA法检测BALF中IL-1β、TNF-α、HMGB1及RAGE含量；Western-blot法测定肺组织HO-1表达。 结果：与Sham组比较，HVT组小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞计数和IL-1β、TNF-α、HMGB1及RAGE含量明显增加，肺损伤评分显著增高（P<0.01）；与VILI组比较，RvD1组小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞计数和IL-1β、TNF-α、HMGB1及RAGE含量明显减少，肺损伤评分显著降低，HO-1表达明显上调（P<0.01）；与RvD1组比较，ZnPP+RvD1组小鼠肺泡灌洗液中性粒细胞计数和IL-1β、TNF-α、HMGB1及RAGE含量明显增加，肺损伤评分显著增高，HO-1表达明显下调（P<0.01）。 结论：消退素D1对小鼠呼吸机相关性肺损伤有一定保护作用，这与其激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ从而诱导血红素加氧酶-1表达上调有关。