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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的自身免疫性疾病,以慢性进行性滑膜炎及破坏性的关节病变为主要特征,其致残率高,对患者工作及生活影响极大。RA的病因及发病机制尚未完全明确,目前尚无根治药物。芍甘附子汤出自《伤寒论》,由白芍、炙甘草和炮附子组成,具有补虚祛实,温经通络,养血舒筋,缓急止痛的功效。临床用该方或以该方加减治疗RA疗效确切,但其具体药效以及作用机制尚缺乏系统研究。为此,本研究采用胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型以及非特异性疼痛、炎症模型,观察芍甘附子汤对RA的干预作用,并初步探讨其可能的作用机制,以期为该方的进一步应用提供实验依据。1芍甘附子汤对胶原诱导性关节炎大鼠的药效研究目的:观察芍甘附子汤对胶原诱导性关节炎大鼠足跖肿胀,血清RF、CRP、IFN-y、IL-17、IL-4、IL-10水平,胸腺、脾脏指数及踝关节病理的影响。方法:采用牛Ⅱ型胶原与不完全弗氏佐剂尾根部注射法复制CIA大鼠模型。将造模成功的大鼠分为模型组、雷公藤多苷片组(9mg/kg)、芍甘附子汤高剂量组(4.2g/kg)、芍甘附子汤中剂量组(2.1 g/kg)、芍甘附子汤低剂量组(1.05 g/kg),并设正常组。各给药组大鼠于首次造模后17日(d 17)开始灌胃给药,1次/日,共给药28 d。采用足跖肿胀率、关节炎指数对大鼠关节肿胀程度进行评价;ELISA法检测末次给药后大鼠血清RF和CRP的含量及首次造模后24日(d 24)、31日(d 31)、38日(d 38)、45日(d 45)血清IFN-γ、IL-17、IL-4和IL-10的水平;末次给药后测量大鼠脾脏、胸腺指数;采用HE染色对大鼠踝关节病理变化进行评价并评分。结果:①足跖肿胀率和关节炎指数:同正常组相比,模型组大鼠在治疗期间足跖肿胀率和关节炎指数均显著增高(P<0.01);同模型组比较,芍甘附子汤可明显降低CIA大鼠足跖肿胀率和关节炎指数(P<0.05或P<0.01)。②RF、CRP水平:与正常组相比,模型组大鼠血清RF、CRP水平明显增高(P<0.05);与模型组相比,芍甘附子汤低剂量组血清RF水平明显下降(P<0.05),高剂量组CRP含量明显下降(P<0.05)。③IFN-γ、IL-17、IL-4、IL-10水平:同正常组相比,模型组大鼠在d24、d31、d38和d45时血清IFN-γ、IL-17水平显著增高(P<0.05或P<0.01),在d 38和d 45时血清IL-4水平显著上升(P<0.05或P<0.01),在d 24、d 38和d 45时血清IL-10水平显著升高(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,芍甘附子汤高剂量组于d 31和d 45时、中剂量组于d 38和d 45时、低剂量组于d 45时IFN-γ水平显著下降(P<0.05或P<0.01),芍甘附子汤高剂量组于d 31和d 38时、中剂量组于d 38和d45时、低剂量组于d31、d38和d45时IL-17水平显著下降(P<0.05或P<0.01),在d31和d38时芍甘附子汤各剂量组IL-4水平显著降低(P<0.05或P<0.01),芍甘附子汤高、低剂量组于d 31、d38和d 45时,中剂量组于d38和d45时IL-10水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。④脾脏、胸腺指数:模型组大鼠的脾脏、胸腺指数较正常组大鼠明显增高(P<0.05);与模型组相比,芍甘附子汤高剂量可明显降低CIA大鼠脾脏指数(P<0.05),芍甘附子汤中、高剂量可明显降低CIA大鼠胸腺指数(P<0.05)。⑤踝关节病理学观察及评分:同正常组比较,CIA大鼠踝关节滑膜炎症明显,并有血管增生及软骨破坏;与模型组比较,芍甘附子汤各剂量组踝关节病理状态有所改善,评分显著下降(P<0.05或 P<0.01)。结论:芍甘附子汤可降低CIA大鼠的足跖肿胀率和关节炎症评分,降低血清RF、CRP含量,调节血清IFN-γ、IL-17、IL-4、IL-10 水平,降低胸腺、脾脏指数,改善踝关节滑膜炎症、血管增生及软骨破坏,降低病理评分。2芍甘附子汤对CIA大鼠MAPK信号通路的影响目的:观察芍甘附子汤对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响,以探讨该方治疗RA的可能机制。方法:建立CIA大鼠模型,采用免疫组织化学法观察芍甘附子汤对CIA大鼠滑膜组织中p38,p-p38表达的影响;采用Western Blot法观察芍甘附子汤对大鼠滑膜组织中JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白表达的影响。结果:与正常组相比,模型组大鼠滑膜组织中p38,p-p38积分光密度(IOD)显著增高(P<0.01);与模型组相比,芍甘附子汤高、中、低剂量均可明显降低滑膜组织中p38,p-p38的IOD值(P<0.05)。同正常组相比,模型组大鼠滑膜组织JNK、ERK、p-ERK表达明显增加(P<0.05或P<0.01),p-JNK表达也呈上升趋势。与模型组相比,芍甘附子汤低、中剂量组大鼠滑膜组织的JNK表达明显降低(P<0.05),芍甘附子汤各剂量组大鼠滑膜组织的p-ERK表达显著降低(P<0.01),p-JNK、ERK表达也呈下降趋势。结论:芍甘附子汤可下调关节滑膜MAPK信号通路中ERK和p38的磷酸化水平。3芍甘附子汤非特异性抗炎、镇痛作用研究目的:观察芍甘附子汤的非特异性抗炎、镇痛作用。方法:采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验、醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高实验观察芍甘附子汤的抗炎作用;采用小鼠醋酸扭体实验、小鼠热板实验观察芍甘附子汤的镇痛作用。结果:同模型组相比,芍甘附子汤各剂量组可降低由二甲苯所导致的小鼠耳廓肿胀度(P<0.01),抑制醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性的增高(P<0.05或P<0.01)。芍甘附子汤各剂量组可减少醋酸所致小鼠扭体反应的次数(P<0.01),高、中剂量组还可显著延长小鼠的扭体潜伏期(P<0.01)。芍甘附子汤高、中剂量组的热板痛阈值较模型组增加(P<0.05或P<0.01)。结论:芍甘附子汤具有一定的抗炎、镇痛作用。综上,芍甘附子汤可减轻CIA大鼠足跖关节肿胀,降低血清RF、CRP水平及胸腺、脾脏指数,改善踝关节病理变化,并具有一定的非特异性抗炎、镇痛作用;其作用机制可能与调节相关细胞因子水平和影响MAPK信号通路有关。