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双酚A(Bisphenol A,BPA)是多种日常生活用品中最常添加的一类化工材料,同时也是一种环境内分泌干扰物质(EEDs),能够扰乱机体的正常生理活动,其中对生殖功能有显著影响。菟丝子补肾安胎。现代药理学研究发现菟丝子黄酮是中药菟丝子的主要成分,菟丝子黄酮有改善雄性和雌性生殖内分泌的功能,但菟丝子黄酮缓解生殖损伤的作用机制还未得到充分揭示,因此,研究菟丝子黄酮对BPA所致生殖损伤的缓解作用以及菟丝子黄酮补肾固精作用的现代分子机制,为保护动物生殖功能,进一步提高动物繁殖力,以及探讨缓解BPA环境污染物生殖毒性的深入研究提供理论参考。BPA剂量筛选试验,将120只孕鼠随机分为6组,每组20只,在妊娠0.5-17.5天灌胃不同剂量(0,2.5 mg/kg/d,5 mg/kg/d,10 mg/kg/d,20 mg/kg/d,40 mg/kg/d)的BPA,每组随机选取15只仔鼠,在断乳(出生后21d,postnatal day 21,PND 21,),性成熟(出生后56d,postnatal day 56,PND 56)时麻醉后采血,分离血清,并收集卵巢,子宫和睾丸。统计母鼠流产率和仔鼠存活率以及仔鼠子宫,卵巢和睾丸系数;放射免疫法检测子代雌鼠血清雌二醇(E2),孕酮(P4),卵泡刺激素(FSH),黄体生成素(LH)水平,子代雄鼠血清雌二醇(E2),睾酮(T)含量。酶联免疫吸附法(ELISA)检测子代小鼠卵巢和睾丸雌激素受体α(ERα),雌激素受体β(ERβ)含量;蛋白免疫印迹和免疫荧光法检测子代小鼠卵巢和睾丸caspase-7,caspase-9,bcl-2,bax蛋白表达情况;TUNEL检测卵巢和睾丸细胞凋亡情况;实时定量荧光PCR法检测小鼠卵巢ERα,孕酮受体(PgR)和睾丸ERαmRNA转录水平。结果显示,BPA对子代雌鼠生殖毒性的表现为:5 mg/kg/d,20 mg/kg/d和40 mg/kg/d BPA可显著提高妊娠母鼠流产率,各剂量BPA均可显著降低仔鼠存活率(P<0.05或P<0.01)。子代雌鼠断乳和性成熟时血清激素与卵巢激素受体水平与BPA存在非单调性剂量-反应关系。BPA可显著提高子代雌鼠断乳时卵巢中ERα和PgR mRNA相对转录水平;极显著提高子代雌鼠断乳和性成熟时卵巢caspase-7,caspase-9,bax凋亡基因蛋白的表达,抑制断乳和性成熟时卵巢bcl-2抗凋亡基因蛋白的表达(P<0.05);极显著提高性成熟时卵巢组织细胞凋亡率(P<0.01);极显著降低子代雌鼠性成熟时卵巢ERα和PgR mRNA相对转录水平(P<0.01)。HE染色观察发现妊娠暴露BPA子代小鼠断乳时卵巢卵泡数量增加,性成熟时卵巢发生萎缩。表明BPA在断乳和性成熟时对子代雌鼠的干扰作用是不同的,在断乳时促进雌激素受体基因表达,使卵巢发育提前,但在性成熟时提高卵巢细胞凋亡率,阻碍卵巢发育。BPA对子代雄鼠生殖毒性的表现为:妊娠期暴露20 mg/kg/d BPA可显著增加断乳仔鼠睾丸系数,40 mg/kg/d BPA可显著降低子代性成熟时睾丸系数(P<0.05)。BPA可显著降低子代雄鼠断乳和性成熟时血清T和E2水平,提高断乳和性成熟时睾丸ERα和ERβ含量,提高睾丸caspase-7,caspase-9,bax的相对表达,降低bcl-2的相对表达,提高性成熟时睾丸内细胞凋亡率(PP<0.01或P<0.05)。表明BPA使T、E2及ERα/β分泌紊乱,损伤睾丸组织,影响子代雄鼠的生殖机能。菟丝子黄酮(Cuscuta chinensis flavonoids,CCFs)保护试验,将120只孕鼠随机分为6组,每组20只,在妊娠0.5-17.5d,模型组灌胃5 mg/kg/d BPA,空白组灌胃等量玉米油,其余组灌胃5 mg/kg/d BPA,同时灌服20、30、40 mg/kg/d CCFs治疗。每组随机选取15只仔鼠,在PND 21和PND 56时麻醉后处死收集血清,卵巢,睾丸。统计母鼠流产率,仔鼠存活率及卵巢,睾丸相关指标。结果显示,在子代雌鼠方面:与BPA模型组相比,CCFs能显著降低母鼠流产率,提高仔鼠存活率(P<0.05);显著降低子代卵巢系数,减轻卵巢凋亡情况(P<0.01);调节子代雌鼠断乳(PND 21)和性成熟(PND 56)时血清激素,卵巢受体和DNA甲基转移酶(DNMTs)水平(P<0.01),其中40 mg/kg/d CCFs组与空白组没有显著差异。40 mg/kg/d CCFs还能显著降低BPA导致的H1 9/Igf2印记基因高甲基化水平。表明CCFs能通过降低DNMTs表达,提高子代雌鼠体内生殖激素及激素受体水平,使H19/Igf2甲基化趋于正常,并降低凋亡蛋白表达及细胞凋亡率,缓解BPA对子代雌鼠造成的生殖损伤。在子代雄鼠方面:与空白组相比,BPA模型组断乳仔鼠在PND21时睾丸系数极显著降低(P<0.01),而在PND 56时无显著差异(P>0.05),睾丸组织结构模糊。BPA还能显著提高仔鼠睾丸内bax、caspase-9和caspase-7蛋白的表达量(P<0.01);并能显著抑制仔鼠睾丸内bcl-2蛋白的表达量(P<0.01),此外,BPA能显著促进睾丸细胞的凋亡率(P<0.01)。而用菟丝子黄酮处理后,与BPA组相比,仔鼠在PND 21时睾丸系数极显著升高(P<0.01),而在PND 56时无显著差异(P>0.05)。仔鼠睾丸内bax、caspase-9和caspase-7蛋白的表达量显著降低(P<0.05);bcl-2蛋白的表达量显著升高(P<0.05)。睾丸内凋亡细胞明显减少(P<0.05)。与空白组相比,BPA模型组断乳仔鼠睾丸系数极显著降低(P<0.01),给予40 mg/kg/d菟丝子黄酮进行保护,断乳仔鼠睾丸系数显著回升(P<0.05);40mg/kg/d菟丝子黄酮能显著降低BPA导致的孕鼠流产率,显著降低ERα甲基化水平(P<0.05);菟丝子黄酮能极显著回升仔鼠血清T,E2含量(P<0.01);菟丝子黄酮能极显著降低BPA导致的仔鼠睾丸ERα,ERβ,Dnmt1含量及ERα,Dnmt1 mRNA相对转录水平的升高(P<0.01);菟丝子黄酮能极显著抑制BPA导致的仔鼠睾丸Dnmt3A,Dnmt3B含量及mRNA相对转录水平的降低。表明中药成分菟丝子黄酮能通过缓解BPA引起的子代雄鼠睾丸细胞大量凋亡,调节子代雄鼠体内生殖激素、激素受体,DNMTs以及ERα甲基化水平,缓解BPA对子代雄鼠产生的生殖损伤。结论本研究初步证实了菟丝子黄酮可以通过调控生殖激素及激素受体,DNA甲基转移酶来缓解BPA引起的生殖损伤,抑制卵巢和睾丸组织内细胞过度凋亡,并抑制卵巢H19/Igf2和睾丸ERα/H19/Igf2的高甲基化。从而达到缓解BPA引起的生殖损伤作用。