人类乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)属于DNA病毒。HBV能引起人类急、慢性肝炎和肝细胞癌。与其他病毒性疾病一样，HBV的感染可能是由病毒外膜上的蛋白与宿主细胞膜上的一个或多个受体结合而引发。HBV只能感染人类和某些灵长类细胞，而缺乏在体外细胞系细胞内的繁殖和传播能力。HBV的复制及细胞损伤主要限于肝脏，肝细胞是HBV的主要宿主细胞，而HBV在肝外存在及复制的意义尚不清楚。 本课题的目的就是要建立一种新型的理想而又经济的HBV受体研究的小鼠模型，并初步探讨SCCA1在体内HBV感染过程中所起的作用。 研究方法质粒构建：质粒pMC-LacZ和pMC-SCCA1按照陈志英等人文献中所描述的方法构建CsCl-密度剃度离心纯化质粒并保存于-20℃。通过对比260和280nm的吸收度以及2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度。 半乳糖苷酶测定(X-gal染色)：用X-gal染色的方法可以测定外源基因LacZ在小鼠肝脏表达与否以及表达位置。小鼠尾静脉高压注射含MC-LacZ质粒的生理盐水2ml后24小时处死动物，做10μm肝脏冰冻切片，X-gal溶液染2小时，核固红复染30秒，阳性细胞的胞质和胞核染成蓝色，阴性细胞为粉红色。 小鼠体内转染pMC-SCCA1：小鼠尾静脉高压注射含质粒pMC-SCCA1的生理盐水2ml，注射速度保持在0.4ml/s。 小鼠注射人类HBV-DNA阳性血清：24小时后小鼠尾静脉注射人类HBV-DNA阳性血清0.3ml，再过24小时小鼠腹腔注射HBV-DNA阳性人类血清0.3ml，然后于适当的时间取小鼠血清和肝脏标本检测。 SCCA1的组织学免疫组化检测：小鼠分组：动物分为五个实验组和一个对照组，实验组小鼠尾静脉高压注射含pMC-SCCA1的生理盐水；对照组小鼠尾静脉高压注射不含pMC-SCCA1的生理盐水。五个实验组分别于第3、7、17、27、37天处死；对照组于第3天处死。每组两只Nod-Scic小鼠。 小鼠分别于实验第3、7、17、27、37天处死，制作肝脏石蜡切片作SCCA1免疫组化检查。 小鼠肝脏HBsAg免疫组化检测：检测方法同上，一抗为山羊抗-HBsAg.小鼠分组：动物分为5个实验组和6个对照组，每组两只Nod-Scid小鼠。所有实验组小鼠于第-2天尾静脉高压注射含pMC-SCCA1的生理盐水2ml，第-1天尾静脉注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，第0天小鼠腹腔注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，五个实验组分别于第3、7、17、27、37天处死；对照组1-5的小鼠于第-2天尾静脉高压注射不含pMC-SCCA1的生理盐水2ml，第-1天尾静脉注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，第0天小鼠腹腔注射含HBV-DNA的乙型肝炎患者血清0.3ml，五个对照组分别于第3、7、17、27、37天处死。对照组6小鼠于第-2天尾静脉高压注射含pMC-SCCA1的生理盐水2ml，第-1天尾静脉注射生理盐水0.3ml，第0天小鼠腹腔注射生理盐水0.3ml，第3天处死。对照组7为正常小鼠，无任何注射。 小鼠血清HBsAg的ELISA检测：采用美国雅培公司HBsAg定性检测试剂盒和配套设备AXSYMsystem检测，操作按照说明书进行。 小鼠血清和肝脏的HBV-DNA-PCR定性检测：分别采用不同方法取得小鼠血清和肝脏的DNA溶液，然后用中山大学达安基因检测中心的HBV-DNA-PCR定性检测试剂盒以及2％琼脂糖凝胶电泳检测。 结果以LacZ作为报告基因，我们可以很方便快捷地检测外源基因的表达与否及位置。在小鼠尾静脉高压注射含MC-LacZ质粒的生理盐水2ml后24小时，肝脏冰冻切片X-gal溶液染色显示外源基因可以在小鼠肝脏内表达，阳性细胞主要聚集在小鼠肝脏中央静脉周围。 SCCA1的表达方式和阳性表达的细胞种类可以通过免疫组化的方法测定。小鼠尾静脉高压注射含MC-SCCA1质粒的生理盐水2ml24小时后，做肝脏石蜡切片检测SCCA1阳性表达细胞。结果显示有一定数量的肝细胞为阳性反应，这些细胞主要聚集在中央静脉和肝窦状隙附近。SCCA1阳性细胞计数结果显示SCCA1的阳性表达率大约30％，并可持续至少37天。 小鼠肝脏的HBsAg的免疫组化结果显示，在不事先注射pMC-SCCA1的小鼠肝脏内，如果直接向小鼠体内输入乙肝患者HBV-DNA阳性血清(对照组)，在小鼠肝脏内将无法检测到HBsAg阳性反应；相反地。在事先注射pMC-SCCA1的小鼠肝脏内，再向小鼠体内输入乙肝患者HBV-DNA阳性血清(实验组)，在小鼠肝脏内可以见到HBsAg阳性反应细胞，这些细胞主要集中在中央静脉和肝窦状隙附近，包括肝细胞、Kupffer氏细胞、肝窦内皮细胞，HBsAg阳性反应长达17天，在实验第27、37天则未检测到阳性细胞。 小鼠血清HBsAg定性ELISA检测显示，在对照组(第一组，不事先尾静脉注射pMC-SCCA1而直接向小鼠体内输入乙肝患者HBV-DNA阳性血清)中，第3天显示阳性，而在第7、17、27、37天均为阴性；而在实验组(第二组，事先尾静脉注射pMC-SCCA1再向小鼠体内输入乙肝患者HBV-DNA阳性血清)中，第3、7天可检测到阳性反应，17天后均为阴性。 HBV-DNA-PCR定性检测结果显示，在对照组中，第3天时小鼠血清和肝脏都为阳性反应，第7天以后，血清和肝脏中均无法检测到HBV-DNA；实验组在第3、7天时，血清和肝脏标本均为阳性，肝脏标本的阳性反应时间更长，到第17天是染为阳性，但27、37天时为阴性反应。 讨论肝脏不仅负责合成多种蛋白，同时也涉及大量的遗传性和获得性疾病的发生发展，所以肝脏也是基因治疗研究的重要靶器官。而载体是转基因的重要工具，目前已经发现了大量的载体工具，包括重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及非病毒载体，例如脂质体、阳离子聚合体和再造乳糜微粒。虽然肝脏转基因研究已经取得很大进展，但每种载体的应用都还存在许多困难和问题。例如，重组逆转录病毒载体虽然可以实现外源基因在肝脏的长期表达。但这一结果需要进行肝部分切除或肝损伤来刺激肝细胞的再生和分化；腺病毒载体可以提高转基因的效率，但由于引起宿主的免疫反应而缩短外源基因的表达时间；腺相关病毒载体可以使外源基因长期表达，但其携带外源基因的长度不能超过5.2kb；目前己知的非病毒载体的转基因效率较低。为了解决在小鼠体内外源基因转染的困难，Zhang等人探索出一种小鼠尾静脉高压注射技术，使外源基因到达并转染小鼠肝细胞，他们的实验证明在进行这种操作后，小鼠肝脏是体内唯一表达外源基因的器官，阳性反应长达6个月以上。在本课题中，我们利用小鼠尾静脉高压注射技术成功地将HBV结合蛋白基因SCCA1转染至HBV的宿主器官——肝脏。 在人类疾病的基因治疗中，由于普通载体会造成外源基因表达逐渐下降，在一定程度上限制了非病毒载体的应用。陈志英等人最先证实了，在载体中与哺乳类动物表达盒(mammalianexpressioncassette)相连的细菌DNA序列导致了体内外源基因的反转录沉默。对此，他们发明了一种)噬菌体φC31整合酶介导的分子内再结合技术，去除造成基因沉默的细菌序列，由此而得到小环DNA载体(minicirleDNAvector)，实验证明，小环DNA载体使报告基因humanfactorⅨandα1-antitrypsin的表达量分别提高了45倍和560倍。小环DNA载体可以为疾病的基因治疗提供有效的工具。在本课题中，我们以小环DNA载体为工具，实现了HBV结合蛋白基因SCCA1的稳定表达，这种转基因小鼠将为HBV受体研究提供非常有用的动物模型。 在此小鼠模型上，我们对HBV结合蛋白基因SCCA1的受体功能进行了初步研究。各项检测结果，不论是免疫组化染色、ELISA或者HBV-DNA-PCR检测，都显示了在小鼠尾静脉高压注射了pMC-SCCA1后，HBV在小鼠体内滞留时间明显延长。这一发现提示pMC-SCCA1的表达产物-HBV结合蛋白有助于HBV与宿主细胞膜的黏附，另外也提示，在介导病毒内吞的过程中，HBV结合蛋白可能是作为联合受体而起重要作用。但其在HBV感染过程中所起的具体作用仍需进一步的研究来证实。 除此之外，我们的研究还发现，肝窦内皮细胞和Kupffer氏细胞在免疫组化染色中呈现较强的阳性反应。这一发现提示这些细胞可能对于HBV病毒的清除具有重要的作用，这些细胞是抵御HBV病毒感染的前沿防线，它们如果出现免疫功能障碍可能会提高HBV感染肝细胞的机会。 本课题的研究结果显示，通过小鼠尾静脉高压注射小环DNA载体的方法，可以实现外源基因，疑似HBV受体基因在小鼠肝脏内的长期稳定的表达，这种小鼠将为HBV受体基因研究提供合适而又经济的动物模型。在此小鼠模型基础上初步研究显示，HBV结合蛋白可以延长HBV在小鼠体内的滞留，在HBV的感染过程中可能还存在其它因素的参与，不断深入的定性定量研究将进一步完善这一动物模型及HBV受体研究。