纤维素作为一种重要的生产生物乙醇的来源物质,由于结构复杂而很难被微生物直接利用。近年来,纤维素的生物降解研究还处于起步阶段,但对于降解过程的机理已经有学者做出各种推测。其中,C1-Cx理论得到学术界的普遍认可。该理论认为纤维素的致密结构先被某种膨胀因子打开,随后被有催化活力的水解酶降解。截至目前,该理论并未得到完整的证实,膨胀因子的研究也仅限于Expansins、Swollenins以及EXLX1蛋白的研究,且其作用机理并不十分明确。因此,寻找具有C1-Cx特性的蛋白并对其作用机理进行深入研究具有十分重要的理论价值。本课题组在前期工作中,从一株具有降解纤维素能力的菌株Arthrobotrys sp.Cx1中分离出一种新型蛋白C22,该蛋白属于糖苷水解酶6家族;前期研究结果表明,C22能够降低滤纸的结晶度并增大其水合度;C22的结构预测分析结果表明,该蛋白由糖苷水解酶6家族(Glycoside hydrolyses,GH6)核心催化区域(CLF)、功能未知连接肽段(Linker)及碳水化合物单元(Carbohydrate binding module,CBM1)三部分构成。为了进一步研究该蛋白的C1-Cx作用机制,本工作围绕C22不同结构域的功能展开研究。本工作构建了CF(含有水合蛋白C22核心催化区域以及Linker)、CLF和CBM-GFP(碳水化合物结合单元-荧光蛋白)重组蛋白,为了研究水合蛋白C22的作用机理,本工作重点对C22、CF和CLF三种重组蛋白进行定量及定性的酶学性质表征,定量实验主要包括:保水值、动力学、蛋白活性检测、纤维素结晶度测定。定性实验包括:通过荧光显微镜观察被CLF重组蛋白处理棉花的形态变化、CLF和CBM分别与不同结晶度Avicel的结合能力。定量实验的结果表明,C22、CF和CLF作用于滤纸,滤纸保水值分别增加了25.6%、21.5%、14.7%,跟水合蛋白C22相比,CF和CLF的保水值都有不同程度的降低,尤其是CLF下降比较明显,说明Linker在水合过程中起主要作用。利用X射线衍射检测被三种重组蛋白处理后的滤纸的结晶度,结果发现三种重组蛋白处理后的滤纸结晶度(CrI)相比未处理的滤纸均降低了13%左右,且没有显著性差异,该结果表明水合蛋白C22的核心催化结构域能够破坏滤纸结晶度,而CBM、Linker不具有破坏纤维素结晶结构的能力。三种重组蛋白进行吸附等温线的测定结果表明,C22、CF和CLF对滤纸和Avicel的吸附能力依次下降,说明水合蛋白C22中的CBM和Linker协助核心催化结构域与滤纸/Avicel结合。定性实验结果表明,CLF处理后的棉花纤维发生明显膨胀,直径变粗,在断裂的节点处膨胀现象更为明显,再次说明水合蛋白C22的核心催化结构域具有破坏纤维素结晶结构的能力,而CBM和Linker不具备。由此,推测水合蛋C22的纤维素水合作用机理为,当C22跟纤维素底物反应时,CBM和Linker协助核心催化域与纤维素底物结合,随后核心催化结构域破坏纤维素结晶区,linker将水分子带入到纤维素内部,使其发生水合作用。本课题的研究为阐明纤维素降解的C1-Cx研究打下重要基础。