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山药是薯蓣科（Dioscorea opposite Thunb）的一种植物。它生长在温暖、低海拔的环境中,分布在整个亚洲,主要集中在韩国、日本和中国。山药是传统的药食两用品种,广泛用于临床治疗和养生保健。国内外的学者研究表明山药多糖具有降血糖、调节血脂功能、抗衰老、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗突变、调节肠胃功能和对肾的滋补作用等等。本文以山药为研究对象,提取山药中主要活性成分多糖（CYP）。对CYP进行初步表征,并通过细胞实验探究CYP的抗氧化活性,进一步结合RNA-seq技术研究CYP保护细胞过程中影响基因的表达情况和具体的作用机制。我们对从山药中提取的CYP进行了纯化,以期获得纯度较高的精制多糖来解析山药多糖的具体结构。大量的体外和体内实验已经证明,山药多糖有着较好的抗氧化能力,山药多糖在自由基的清除效果上表现良好,同时对细胞受到过氧化氢刺激造成的氧化应激也有着较好的保护作用。但是山药多糖在应对由过氧化氢的刺激造成的细胞氧化损伤的保护作用机制还不清楚,仍有待进一步研究。本文主要研究内容如下:1.采用水提醇沉结合酶辅助法提取山药多糖CYP,分析CYP的化学组成,分子量和单糖组成等。理化性质结合紫外光谱证明了酶法与sevage法联用有效地去除多糖中大部分的蛋白质,红外光谱中证明了羧基的存在,糖醛酸的含量分析与单糖组成结果表明CYP是一种酸性杂多糖。CYP的中性糖,糖醛酸和蛋白质的含量为33.62±0.08%,34.95±0.21%和5.21±0.26%。CYP的分子量为20.89 k Da,Rha、Xyl、Glc、Gal、Gal A和Ara是CYP的单糖组成,此外扫描电镜的结果显示CYP多呈碎片状,表面较为光滑。通过柱层析法和分级醇沉法对山药多糖进行了纯化。从这两种方法中,收集得到了CYP-0,CYP-0.1,CYP-0.2,CYP-0.3,CYP-0.4,CYP-0.5,CYP-30,CYP-50和CYP-70这9种纯化多糖。洗脱结果显示柱层析法纯化的多糖里CYP-0.2,CYP-0.3和CYP-0.4的糖含量较高,可以进行下一步的研究。理化性质的测定得到了这几种多糖的化学成分含量。CYP-0.2,CYP-0.3和CYP-0.4的中性糖,糖醛酸和蛋白质的含量为:11.52±0.14%,14.89±0.35%和11.75±0.22%;19.4±0.39%,42.79±0.26%和12.6±0.73%;0.03±0.01%,0.02±0.01%和0.07±0.01%。可以看到总糖含量只有CYP-0.3超过了55%,因而在柱层析法中选取CYP-0.3做后续的研究。分级醇沉得到的三种多糖CYP-30,CYP-50和CYP-70的中性糖,糖醛酸和蛋白质的含量为:45.50±0.53%,41.60±0.87%和61.50±0.64%;34.18±0.60%,35.78±0.62%和20.17±0.14%;3.5±0.10%,5.00±0.12%和4.7±0.21%。三种多糖的总糖含量都大于75%,理化性质结果表明分级醇沉法能够有效地提高多糖的总糖含量,是一种较好的山药多糖的纯化方法。CYP-0.3的分子量较小为1.85 k Da,分级醇沉得到的三种多糖的分子量与CYP的比较接近,CYP-30的分子量为17.03 k Da,CYP-50的分子量为15.84 k Da,CYP-70的分子量为13.15 k Da。Rha、Xyl、Glc、Gal、Gal A和Ara仍然是四种主要纯化多糖的单糖组成。2.通过过氧化氢诱导建立了IEC-6细胞氧化损伤模型以研究CYP的保护作用。结果表明,CYP对IEC-6细胞并无毒性,H2O2刺激IEC-6细胞的最适浓度为300μM,并且CYP的预处理能够减缓H2O2的刺激所造成细胞活力的下降。CYP能够抑制由H2O2所造成的氧化应激,将SOD的活性恢复到接近对照组的水平,同时降低了主要的脂质过氧化物MDA的含量,细胞流式实验也反映了在H2O2处理后细胞内的ROS水平显著上升,CYP能够降低ROS的水平。CYP也能对肠道屏障起到保护作用,肠道紧密连接蛋白是肠道屏障的重要组成部分,WB实验结果证实CYP能够抵抗H2O2处理导致的ZO-1、Occludin、Claudin-1这三种蛋白表达量下降。3.基于RNA-seq分析CYP对H2O2致IEC-6细胞损伤基因表达及其信号通路的影响。结果显示,与空白对照组相比较,CYP组共鉴定出2637个差异表达基因,其中上调的基因有1563个,下调的基因有1074个;模型组共有3712个差异表达基因,其中上调的基因由2630个,下调的基因有1082个;在模型组与CYP组比较中,共有1407个差异表达基因,其中上调的基因由358个,下调的有1049个。富集分析结果显示在H2O2处理后,细胞分化,蛋白结合等基因变化明显,提示H2O2可能通过促进细胞的分化和影响紧密连接蛋白来损伤细胞。IL-17信号通路和MAPK信号通路等在整个过程中都有着明显的变化。MAPK通路实验与ERK抑制剂处理实验说明,CYP预处理降低了MAPK通路中相关蛋白磷酸化的表达,并且这种效果与ERK抑制剂接近。这也证明了CYP的预处理可以通过抑制MAPK通路的激活,降低H2O2导致的细胞氧化损伤和肠屏障损伤。