论文部分内容阅读
背景肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是1995年Wiley等发现的TNF超家族成员,能够诱导多种肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响。TRAIL通过与肿瘤细胞膜上的相应受体结合诱导细胞凋亡,目前发现TRAIL有5种类型的受体,其中TRAIL受体1(死亡受体4,death receptor 4, DR4)和RAIL受体2(死亡受体5,death receptor 5, DR5)胞内段含有死亡结构域,能够传递凋亡信号,其他三种受体:TRAIL受体3(DcR1)、TRAIL受体4(DcR2)和OPG(Osteoprotegerin)可阻断TRAIL诱导的凋亡,称为“诱骗”受体。虽然天然TRAIL有良好的抗肿瘤作用,但实验发现某些rhTRAIL对正常肝细胞等有细胞毒性,这使人们对其生物安全性产生了怀疑。研究发现一些抗DR4或DR5的功能性单克隆抗体(mAb)能够模拟TRAIL的作用,诱导肿瘤细胞凋亡,且无肝细胞毒性,因此抗人DR4和DR5的功能性单克隆抗体(mAb)成为目前TRAIL肿瘤生物治疗的新靶点。我们利用重组人DR5蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了功能性抗DR5单克隆抗体-mDRA-6,前期研究表明mDRA-6可有效诱导多种肿瘤细胞凋亡,同时发现不同肿瘤细胞对其敏感性存有较大差异。虽然肿瘤细胞对mDRA-6敏感性的高低可能与细胞DR5表达、细胞内凋亡信号分子数量及激活状态、细胞内抗凋亡分子变化等诸因素有关,但mDRA-6与细胞DR5结合是启动细胞凋亡的前提,因此推测细胞DR5表达水平是影响mDRA-6诱导细胞凋亡的重要因素。本研究通过分析白血病细胞DR5表达与mDRA-6诱导细胞凋亡的关系,探讨提高细胞DR5表达是增强mDRA-6凋亡诱导作用的有效途径。目的检测不同白血病细胞系细胞表面DR5表达、细胞DR5蛋白表达、细胞DR5mRNA表达水平,分析抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞凋亡与细胞DR5表达的关系。观察维生素E琥珀酸酯(Vitamin E Succinate; VES)对白血病细胞DR5表达的影响,探讨VES增加mDRA-6诱导白血病细胞凋亡作用及可能机制。方法MTT法检测mDRA-6对白血病细胞Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞的生长抑制作用;Annexin V–FITC/PI双染定量分析白血病细胞凋亡;流式细胞术检测细胞表面DR5表达;免疫印迹技术(Western blotting)检测细胞DR5蛋白表达情况;RT-PCR法检测细胞DR5mRNA表达。结果1. MTT检测表明,浓度为10μg /ml的mDRA-6作用12h,白血病Jurkat、U937、HL-60、Raji细胞死亡率分别为88.25%, 61.43%,59.76%,21.98%,K562的细胞死亡率仅为5.23%。5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的VES与mDRA-6分别共同作用于Raji和K562细胞,Raji细胞死亡率分别增加至24.67%(P﹥0.05)、35.65%(P<0.01)和40.22%(P<0.01);K562细胞死亡率增加至6.00%(P﹥0.05)、7.89%(P<0.01)、8.67%(P<0.01)。2. AnnexinⅤ/PI双染检测5μg/ml的mDRA-6作用白血病细胞12h,Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞凋亡率分别为85.96%、50.22%、48.11%、23.40%和7.20%。2μg/ml的mDRA-6单独作用Raji、K562细胞16h,细胞凋亡率分别为20.79%和7.74%,2μg/ml的mDRA-6与10μmol/L的VES共同作用Raji、K562细胞16h,细胞凋亡率分别增至43.18%和16.99%。3.白血病细胞Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞表面DR5表达分别为94.8%、74.71%、58.66%、42.35%和14.92%;Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞表面DR5表达与mDRA-6诱导的细胞凋亡呈明显正相关(r=0.9712,t=7.063,p<0.01)。10μmol/L的VES作用Raji、K562细胞12h后,细胞膜DR5表达率分别增加至70.08%和16.38%。4.免疫印迹技术检测显示,细胞DR5蛋白表达强弱依次为Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562。Raji和K562细胞DR5蛋白基础表达量较少,5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的VES分别作用于Raji和K562细胞12h,Raji和K562细胞DR5蛋白表达量均增加,10μmol/L、20μmol/L的VES诱导DR5蛋白表达增加显著。5.白血病细胞系Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞DR5mRNA相对量分别为:306.82±106.36,214.48±93.56,198.47±78.45,123.68±67.23,45.29±26.39;Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞DR5mRNA表达与mDRA-6诱导的细胞凋亡呈明显正相关(r=0.9915,t=13.22,p<0.01)。20μmol/L的VES作用Raji细胞12h,细胞DR5mRNA表达显著增加(p<0.05),5μmol/L、10μmol/L的VES作用Raji细胞12h及5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的VES作用K562细胞12h,虽能使细胞DR5 mRNA表达增加,但无统计学意义。结论1. mDRA-6能够诱导人白血病Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞凋亡,但不同白血病细胞系细胞对mDRA-6的敏感性不同。Jurkat、U937、HL-60、Raji和K562细胞表面DR5表达及DR5mRNA表达与mDRA-6诱导的细胞凋亡呈明显正相关,白血病细胞系细胞对mDRA-6的敏感性不同与细胞DR5表达差异有关。2. VES增加Raji和K562细胞膜DR5表达、DR5蛋白表达及DR5mRNA表达,同时能够增强mDRA-6对白血病细胞系Raji和K562细胞的凋亡诱导作用。VES增加Raji和K562细胞DR5表达可能是其增强mDRA-6凋亡诱导作用的机制之一。