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目的:siRNA能高效且特异地阻断目的基因的表达,但siRNA在体循环中易被降解,不能有效到达病变部位发挥作用。因此构建合适的递药系统将siRNA递送至靶部位,是siRNA发挥疗效的首要条件。为了改善siRNA在体内的转染活性,本文合成了柠槺酸修饰的胆固醇衍生物,将其修饰于负载siRNA的磷酸钙脂质混合纳米粒表面,旨在构建一种具备电荷翻转功能的性能良好的siRNA递送系统,改善其在血液循环中的稳定性,有利于脂质混合纳米粒将siRNA释放到细胞浆,以期提高siRNA的体内转染活性。方法:(1)以胆固醇(CHOL)、6-氨基己酸(AA)和柠槺酸酐(Cit)为原料,通过化学合成得到化合物3(CHOL-AA)和化合物4(CHOL-AA-Cit),波谱学方法鉴定合成产物结构。(2)以靶向Bcl-2的siRNA(siBcl-2)为模型基因,采用微乳法制备磷酸钙纳米核,薄膜分散法制备负载siBcl-2的磷酸钙脂质混合纳米粒(LNPS@siBcl-2),通过改变脂质外层dotap、化合物3和化合物4的含量优化处方。通过纳米粒度及zeta电位分析仪和透射电镜表征纳米粒。(3)采用mtt实验检测未负载sibcl-2的空白磷酸钙脂质混合纳米粒对a549细胞的毒性;以lipofectamine2000@sibcl-2为阳性对照,检测lnps@sibcl-2对a549细胞的毒性。通过caspase-3活性检测试剂盒检测lnps@sibcl-2纳米粒对a549细胞中caspase-3活性的影响。westernblot方法检测lnps@sibcl-2纳米粒对bcl-2蛋白的沉默效应,并检测调亡相关蛋白bax和caspase-3的表达,探讨lnps@sibcl-2纳米粒诱导a549细胞凋亡的机制。(4)通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2纳米粒的摄取,以及转运cy5-sibcl-2在a549细胞内的分布情况,并对a549细胞摄取lnps@cy5-sibcl-2的机制进行研究;利用a549细胞建立体外三维a549细胞球模型,激光共聚焦显微镜检测lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2在a549细胞球中的穿透能力。(5)构建裸鼠a549细胞移植瘤模型,以生理盐水为空白对照,lnps@scrambledbcl-2为阴性对照,检测lnps@sibcl-2的体内抗肿瘤活性;荷瘤裸鼠尾静脉注射lnps@sibcl-2后,每隔三天记录一次肿瘤的体积和裸鼠的体重变化情况。裸鼠尾静脉注射lnps@cy5-sibcl-2后,分离主要脏器和肿瘤组织,活体成像仪检测lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2在荷瘤裸鼠主要脏器及肿瘤组织的分布;制备脏器和肿瘤组织冰冻切片,通过dapi染色,激光共聚焦显微镜检测lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2在各脏器和肿瘤组织切片的分布;h&e染色观察荷瘤裸鼠主要脏器和肿瘤组织的形态变化。治疗结束后,取治疗组和对照组裸鼠肿瘤组织,匀浆后提取肿瘤组织总蛋白。westernblot检测肿瘤组织bcl-2,bax和caspase-3的表达。结果:(1)经波谱学鉴定,合成产物为目标产物。通过处方筛选,得到的最优处方为:chol-aa/dotap/chol-aa-cit=150/225/150(体积,三个脂质浓度均为10mmol/l)。制备的负载sibcl-2磷酸钙脂质混合纳米粒在ph7.4条件下平均粒径为80nm,zeta电位为-13mv;ph5.0条件下,粒径为1506nm,zeta电位为+9mv。(2)mtt实验结果显示,空白磷酸钙脂质纳米粒对a549细胞没有细胞毒性;体外转染活性实验结果表明,lnps@sibcl-2能浓度依赖性地抑制a549细胞的增长且转染活性优于阳性对照lipofectamine2000@sibcl-2;caspase-3活性检测试剂盒检测结果显示lnps@sibcl-2纳米粒能浓度依赖的上调a459细胞中caspase-3的活性;westernblot结果显示,lnps@sibcl-2能下调a549细胞bcl-2的表达,同时上调bax和caspase-3的表达,且呈浓度依赖性。上述结果提示lnps@sibcl-2通过下调bcl-2的表达,上调bax和caspase-3的表达发挥体外抗肿瘤活性。(3)流式细胞仪和激光共聚焦检测结果显示,随着孵育时间的增长,a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取量增加;孵育介质ph降低,a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取量增加。提示a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取呈现时间依赖性和ph依赖性。低温(4℃)和atp消耗剂均能抑制a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取,提示a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取是耗能过程;细胞摄取抑制剂蔗糖(网格蛋白途径摄取抑制剂)、甲基-β-环糊精(小窝蛋白途径摄取抑制剂)和秋水仙素(大胞饮途径摄取抑制剂)均能抑制a549细胞对lnps@cy5-sibcl-2的摄取,其中秋水仙素对细胞摄取的抑制最显著,提示lnps@cy5-sibcl-2进入a549细胞的主要方式是大胞饮。激光共聚焦显微镜观察结果显示lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2可从溶酶体逃逸,使cy5-sibcl-2分布于细胞浆。(4)激光共聚焦显微镜检测lnps@cy5-sibcl-2转运cy5-sibcl-2在a549细胞球中的分布,结果显示lnps@cy5-sibcl-2能转运sibcl-2到达a549细胞球内部。(5)体内抗肿瘤活性结果表明,lnps@sibcl-2能有效抑制裸鼠a549细胞移植瘤的生长。在尾静脉注射lnps@sibcl-2治疗期间,荷瘤裸鼠体重未出现明显下降。lnps@cy5-sibcl-2能使cy5-sibcl-2在肿瘤组织富集。h&e染色表明,lnps@sibcl-2能降低a549细胞的恶性程度,抑制其生长。westernblot结果表明lnps@sibcl-2能下调肿瘤组织bcl-2的表达量,上调bax和caspase-3的表达从而抑制a549细胞移植瘤生长。结论:lnps@sibcl-2具有酸敏特性,显著提高了sibcl-2的转染活性,能使cy5-sibcl-2在肿瘤组织富集。lnps@sibcl-2通过下调抑凋亡蛋白bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白BAX和Caspase-3的表达发挥抗肿瘤作用。酸敏材料修饰的磷酸钙脂质混合纳米粒是一种理想的siRNA递送系统。