目的:肝癌（liver cancer）是我国最常见的恶性肿瘤之一,位居全球恶性肿瘤发病率的第6位,肿瘤死亡率的第3位。其中,85%的原发性肝癌为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。近年来,对于肝癌的临床和基础研究取得了长足的进步,但总体而言肝癌患者预后并无明显改善,中晚期肝癌患者5年存活率不足10%。其中,强大的肿瘤异质性是导致HCC肿瘤耐药和肿瘤转移复发最主要的原因。随着肝癌进展产生的肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSC）具有无限增殖和分化的能力,产生不同亚克隆,促进肿瘤异质性的发生。CSC的发生发展,一方面由自身突变累积所导致,另外与其所处肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment,TIME）的作用密不可分。本研究通过单细胞转录组学测序技术探究了肝癌空间异质性并找到了维持HCC-CSC干性的基因TOP2A,并进行了机制探究。本研究主要分为两部分四章节。第一部分为基于单细胞转录组学测序技术的HCC肿瘤空间异质性研究,包括肿瘤细胞异质性和肿瘤干性分析以及肿瘤免疫微环境空间异质性和细胞交互分析两章;第二部分为TOP2A通过Hippo信号通路促进HCC进展的机制研究,分为高表达的TOP2A对HCC肿瘤生物学表型的作用和Hippo信号通路是TOP2A促进HCC进展的关键途径两个章节。方法:（1）HCC样本测序后进行数据质控。来自单个细胞的RNA-seq数据通过表达的Marker genes识别其细胞类型。选择上皮细胞进行后续分析。通过拷贝数变异从上皮细胞中判定肿瘤细胞。通过共识非负矩阵分解（c NMF）对全部肿瘤细胞进行功能聚类。肿瘤内异质性分析和分化潜力熵值用于检测肿瘤细胞亚群的干性。随后,通过伪时间轨迹分析检测肿瘤细胞不同亚群的演变性变化。找到的CSC亚群特异性表达基因通过TCGA的队列进行验证分析。（2）在TIME中分别选取T细胞、B细胞、髓系细胞进行单细胞转录组学测序后分析。T细胞和B细胞根据转录组差异分群后,比较不同空间位置不同亚群细胞的分布,随后针对T细胞和B细胞亚群进行了发育分析和功能富集分析。髓系细胞根据表达Marker genes降维后进行亚群分析;随后进一步对巨噬细胞亚群进行基因表达和功能分析。细胞通讯分析用于检测肿瘤细胞与其他细胞之间的相互作用。共培养实验验证HCC肿瘤细胞的干性的可能原因。（3）通过c Bio Portal检测TOP2A突变比率。加权基因共表达网络分析预测TOP2A相关生物学功能。q RT-PCR和Western blot检测HCC组织和细胞系中的TOP2A的表达。CCK-8、平板克隆、细胞划痕、Transwell和流式细胞术检测TOP2A在HCC细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡中的作用,并通过Western blot检测HCC细胞增殖相关蛋白、周期相关蛋白和上皮间质转化相关蛋白的表达。建立皮下移植瘤模型验证TOP2A对体内肿瘤发生的影响。（4）使用生物信息学预测TOP2A下游信号通路,并使用通路抑制剂来验证TOP2A在促进HCC肿瘤恶性表型中的作用。随后,我们通过STRING找到TOP2A作用于信号通路的媒介因子。核质分离和Western blot用于具体机制研究。免疫共沉淀（co-IP）用于验证直接作用机制。结果:（1）我们从15个样品中通过单细胞转录组技术共捕获82,030个细胞,归为5种主要类型,包括上皮细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞和内皮细胞。随后,我们从上皮细胞中鉴定出具有患者间异质性和拷贝数变异特征的肿瘤细胞亚群。其中,我们发现肿瘤细胞具有空间分布特征。部分肿瘤细胞亚群（Cluster 12、15、17、20）表现高干性和高分化潜能,考虑为肝癌干细胞（liver cancer stem cells,LCSC）。c NMF证实LCSC亚群功能,并发现免疫相关肿瘤细胞亚群。此外,肿瘤细胞发育分析中发现具有免疫调节作用的肿瘤起始细胞（tumor initiating cells,TIC）和处于发育晚期的TOP2A+CENPF+LCSC,二者均具有空间特异性,分布在肿瘤边缘。（2）TIME中免疫细胞主要包括T细胞、B细胞和髓系细胞。T细胞分为11个Cluster;其中,肿瘤内浸润的T细胞主要为发育晚期的增殖型耗竭T细胞（exhausted T-cell,Tex）。B细胞分为7个Cluster;存在于肿瘤内的主要为Plasma2、4、6,功能富集于氧化磷酸化,具有个体间特异性。髓系细胞降维后分为11个Cluster,共6类,其中巨噬细胞和Kupffer cell具有空间特异性;巨噬细胞根据表达Marker genes和功能富集分为M1和M2两种亚型。细胞通讯分析发现CD168+M2样巨噬细胞与肿瘤细胞和LCSC亚群存在很强的相互作用;TIC可以通过趋化因子募集CD168+M2样巨噬细胞。共培养实验证明M2型巨噬细胞可促进HCC细胞肿瘤干性基因表达上调。（3）TOP2A在肝癌中有较高的突变率,并与细胞周期、DNA复制等功能密切相关。我们发现TOP2A在HCC组织和细胞系中表达显著上调。敲减TOP2A可抑制HCC细胞的增殖、侵袭、迁移能力,并改变HCC细胞周期分布,促进细胞凋亡。上述细胞接种裸鼠皮下表现为肿瘤生长抑制。过表达TOP2A则促进HCC细胞增殖、侵袭、迁移,抑制细胞凋亡。体内实验证明上调TOP2A促进裸鼠皮下肿瘤的生长。改变TOP2A表达可影响HCC细胞中增殖相关蛋白、细胞周期蛋白和上皮间质转化相关蛋白的表达。（4）功能富集发现TOP2A可能通过Hippo通路发挥生物学效应。通路抑制剂实验证明了TOP2A通过Hippo信号通路促进HCC肿瘤进展。研究发现Verteporfin（VP）可抑制HCC细胞增殖、侵袭、迁移,并且VP可逆转由TOP2A过表达导致的HCC肿瘤细胞恶性表型。敲减或过表达TOP2A会改变Hippo信号通路中YAP1的表达水平。核质分离和co-IP实验表明,核内过表达的TOP2A吸附β-catenin,导致YAP1游离入核,促进Hippo通路下游基因的转录。此外,敲减HCC细胞中TEAD4可以减少TOP2A表达。TOP2A和Hippo形成环路。结论:（1）HCC实体瘤内肿瘤细胞存在空间异质性;肿瘤细胞亚群内存在发育早期具有免疫调节作用的CCL5+CD52+TIC和处于发育晚期的TOP2A+CENPF+LCSC,这些细胞特异性分布在肿瘤边缘,共同构成肿瘤细胞异质性。（2）在肿瘤免疫微环境中,T细胞、B细胞、髓系细胞存在空间分布特征;瘤内浸润的免疫细胞大多数为高增殖免疫耗竭型;其中,CD168+巨噬细胞呈现M2表型,促进肿瘤细胞干性。（3）TOP2A在肿瘤组织和HCC细胞系中异常高表达,并对肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和在体成瘤起到促进作用,影响细胞周期分布,抑制细胞凋亡。（4）胞核内TOP2A通过β-catein影响Hippo信号通路,促进HCC的发生进展。