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随着人们环保意识的增强,漆酶以其独特的底物适应性和氧化特性在许多领域得到应用。本研究对产生漆酶的菌株进行理性改造,获得催化活性明显改良的突变酶,为其在环保、生物检测、医药等领域的进一步应用提供了理论依据。本课题主要研究内容如下:1、产漆酶菌株筛选及突变菌株选育从环境中选取可能存在漆酶产生菌的土壤及水样,样本分别采自安徽宣城木瓜园、北京门头沟妙峰山、山东省马耳山三处富含腐烂枝叶的土壤及染料工厂排水渠的水样。以漆酶产量最高的野生真菌变色栓菌(Trametes versicolor)作为起始菌株进行紫外诱变和常压室温等离子体诱变,获得14组突变菌株:较起始菌株,UV诱变获得的FG-18-2-1菌株的酶活为3.96 U/m L,提高了2.22倍;ARTP(Atmospheric and Room Temperature Plasma,)诱变获得的FG-18-4-1菌株的酶活为6.48 U/m L,提高了4.30倍。遗传稳定性实验显示:经5次传代培养后,与起始菌株相比,FG-18-2-1的酶活下降57.79%,FG-18-4-1的酶活下降21.70%;FG-18-4-1,FG-18-2-1遗传稳定性分别为78.30%和42.21%。经菌种鉴定,确定产量最高的真菌菌株为变色栓菌(Trametes versicolor)突变菌株FG-18-4-1。2、白腐真菌漆酶酶学性质的研究将紫外诱变和常压室温等离子体诱变后分别获得的FG-18-2-1和FG-18-4-1发酵液进行分离纯化与酶学性质的相关研究。连续纯化后,以ABTS为底物,测得FG-18漆酶的比活力为165.50 U/mg比活力比纯化前提高30.62倍,活力回收率为18.10%;FG-18-2-1漆酶的比活力为203.5 U/mg,比纯化前提高23.71倍,活力回收率率为14.69%;FG-18-4-1漆酶的比活力为462.20 U/mg,比纯化前提高40.45倍,活力回收率为12.05%。3、白腐真菌产漆酶培养条件的优化对突变菌株FG-18-4-1漆酶的温度、p H适应性和稳定性进行分析。结果表明:漆酶最适温度为40℃;出发菌漆酶在25-60℃保持一定活性,温度适应性表现良好,55℃温育10分钟已经几乎完全失活。而突变菌株漆酶在55℃温育10分钟酶活降低至54%,60分钟后酶活仍保持20%左右。突变菌漆酶温度稳定性表现较好。突变菌株FG-18-4-1漆酶最适p H为4.4,起始菌株漆酶最适p H为4;p H为5时,FG-18-4-1和起始菌株漆酶酶活分别保持97.11%和69.95%,p H稳定性得到了较大的提高。单因素发酵优化实验用摇瓶和5 L发酵罐进行,试验确定条件为碳源浓度为10.00 g/L,氮源添加浓度为22.00 g/L。(1)碳源单因素实验组中葡萄糖为对照组,实验组中蔗糖组的漆酶酶活最高,在发酵第8天达到8.37 U/m L,为对照组的2.40倍,且达到最高酶活的发酵时间较对照组缩短1天,选定蔗糖为突变菌株FG-18-4-1漆酶发酵的最佳碳源。(2)氮源单因素实验中酒石酸铵为对照组,实验组中富含有机氮的酵母膏组漆酶酶活最高,在发酵第9天达到8.18 U/m L,为对照组的2.34倍;硫酸铵组的漆酶酶活次之,在发酵第9天达到6.28 U/m L,为对照组的1.80倍。考虑实际生产及应用成本,选择硫酸铵作为最佳氮源。(3)诱导剂选用低成本的硫酸铜,漆酶的酶活随铜离子添加量的增多而提高,添加2 m M硫酸铜的发酵组最高酶活达到8.67 U/m L,为未添加组的2.48倍。突变菌株FG-18-4-1发酵产漆酶的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为硫酸铵,诱导剂铜离子的最佳添加量为2 m M。通过响应曲面法对漆酶发酵工艺进行优化:模型P值小于0.0001表现为极显著最终得到的最佳漆酶发酵工艺条件:蔗糖添加量为10.09 g/L,硫酸铵添加量为21.74 g/L,硫酸铜添加量为1.32 m M;漆酶的总产量预测值为15.96 U/m L,而实际总产量为15.90U/m L,较发酵条件优化前酶活提高4.56倍。