鱼类是一种外温(异温)的水生生物,环境温度是影响其生长、发育、免疫、新陈代谢和繁殖等的主要因素。低温压力对鱼类的生存是一个重大的挑战,严重时甚至会导致其死亡,其中不乏具有重要商业价值的水产养殖物种。因此,研究低温压力对鱼类生存的影响具有很大的价值和意义。斑马鱼(Danio rerio)是一种繁殖周期短、产卵量大的淡水热带鲤科鱼类,是遗传、发育和生物医学领域最重要的脊椎动物模型之一。野生型斑马鱼生存温度范围很广(16-40°C),是一个很好的研究低温驯化的模式生物。并且通过实验室前期的研究发现,DNA甲基化和长链非编码RNA(lnc RNAs)参与了斑马鱼ZF4细胞中18°C低温驯化30 d条件下的低温压力响应的过程。Micro RNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的单链内源性非编码RNA,在动植物内广泛存在。miRNA通过碱基间配对结合靶mRNA的3’UTR中与其完美或近乎完美互补的序列基序结合,使相应靶mRNA裂解或抑制其翻译,调控其表达。大量研究表明,miRNA参与调节植物和动物对低温压力的适应。然而,目前对低温胁迫的研究主要集中在植物上,一些关于哺乳动物的研究是集中在对急性低温胁迫下的调控作用。而对鱼类的研究主要集中在基因组和编码基因转录组,对鱼类低温适应与miRNA调控相关的研究较少。本文采用高通量测序技术检测了28°C,30 d(对照组)和18°C,30 d(冷驯化组)两个条件下的斑马鱼胚胎成纤维ZF4细胞的miRNA表达谱,鉴定出一些与斑马鱼在冷压力作用下相关的miRNA。主要研究方法和结果如下:1、将培养最适温度为28°C的斑马鱼成纤维ZF4细胞转移到18°C培养30 d作为冷驯化组,将培养最适温度(28°C)下的ZF4细胞培养30 d作为对照组,通过高通量测序技术检测两组细胞中的miRNA表达谱。通过生物信息学分析,共鉴定出414个miRNAs,其中已知的miRNAs有349个,新发现的miRNAs有65个。对鉴定出的mi RNA使用R包DEseq进行差异表达分析得到了47个有显著差异表达的miRNAs,其中24个miRNAs(已知19个,新的5个)在冷驯化细胞中表达上调,23个mi RNAs(已知9个,新的14个)表达下调。2、为了研究差异表达的miRNA(differentially expressed miRNA,DE-miRNA)参与到的功能,使用mi Randa软件预测了DE-mi RNA的靶基因。GO(Gene Ontology,基因本体论)和KEGG(Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)富集分析表明,已知DE-miRNA的靶基因通过调控磷酸化、细胞黏连、细胞内信号转导、ECM受体相互作用等参与冷驯化。3、此外,选取两个差异表达的miRNAs,并对ZF4细胞分别转染miRNA抑制剂和模拟物。结果表明,miR-100-3p抑制剂和miR-16b模拟物均能在10°C的冷胁迫下保护ZF4细胞,这提示了miRNA参与了斑马鱼细胞的冷驯化过程。进一步通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)实验证明了miR-100-3p和miR-16b可以反向调控靶基因(atad5a,cyp2ae1,lamp1,rilp,atxn7,tnika,btbd9)的表达。4、通过对斑马鱼胚胎注射miR-100-3p的模拟物和抑制剂发现,从6 hpf(6hours post fertilization,受精后6小时)起,过表达miR-100-3p的斑马鱼的早期胚胎发育死亡率显著增加,抑制miR-100-3p对斑马鱼的早期胚胎发育则没有显著影响。这提示miR-100-3p对斑马鱼早期发育具有重要调控作用。综上所述,在本研究中,通过高通量测序系统地描述了冷驯化条件下斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4细胞中miRNA的变化。在冷驯化条件下,ZF4细胞中有28个保守的和19个新的miRNAs显著差异表达。这些DE-miRNAs参与调控磷酸化、细胞黏连、细胞内信号转导、ECM受体相互作用等。进一步的研究表明,ZF4细胞通过调控miR-16b和miR-100-3p的表达促进细胞存活来适应冷压力环境。目前的数据表明,miRNA与斑马鱼ZF4细胞的冷驯化密切相关,为进一步了解miRNA在鱼类冷驯化中的作用提供了信息。