一、研究目的本课题通过理论与实验研究,探讨皂荚提取物对原发性肝癌是否具有明显的改善和治疗作用,同时研究皂荚提取物组、索拉菲尼组、空白组和模型组对大鼠肝癌的疗效差别,从而探讨皂荚提取物治疗原发性肝癌的机制,为临床正确合理使用皂荚治疗原发性肝癌提供实验依据。二、研究方法第一部分理论研究1.皂荚及其提取物临床上对治疗原发性肝癌的效果非常突出,且不良反应较少,与肝癌的治疗和预后关系密切。2.肝癌内的微血管密度可以作为一个新的生物学特征,它反应了癌细胞的发展、浸润、转移的程度,可以作为肿瘤转移的预测因子和指标。第二部分实验研究1.肝癌模型的建立1.1大鼠腹水瘤的建立将Walker-256细胞株先置于-80℃的冰柜里冻存,待用时将其从冻存管中取出,然后放到水浴当中(37℃),待细胞株完全融化后,从冻存管取出。用吸管不停地吹打细胞悬液,然后转移到离心管当中(15ml)。缓慢加入8ml PBS缓冲液,并轻轻晃动离心管。然后以1000转/分的速度离心离心管10min,清除上清,用PBS缓冲液清洗2次。随后用PBS缓冲液4ml重悬细胞,在5只Wistar大鼠的腹腔内分别注入1ml的细胞悬液。1个月后大鼠腹部会逐渐膨起,此时形成癌性腹水。1.2种植用腹水瘤的制备在传代的Wistar大鼠体内抽取癌性腹水5ml(基本呈淡红色洗肉水样),放于离心机内进行离心(以2000转/分的速度离心2min)。然后弃去上层清亮淡色液体,抽取下层粘稠的浓缩腹水1ml,作为备用。1.3肝癌模型首先对大鼠腹腔内注射水合氯醛(按40μg/100g体重进行配制)进行麻醉,把大鼠以呈仰卧位固定于鼠板上,用0.5%活力碘消毒腹部,顺着腹白线剪开并逐层分离腹部,大鼠的腹腔脏器会逐渐显现,肝脏在上腹部膨出。把最外层肝叶作为实验标本,将乘有癌性腹水的注射器以30度的倾斜角度刺入肝脏内约0.5cm,轻轻推送癌性腹水约0.05ml。然后拔出注射器针头,用消毒棉签按压在注射点直到不出血为止。将肝脏重纳入腹腔后,关闭腹腔。采用红霉素软膏擦拭消毒伤口。共制备50只大鼠肝癌模型,然后进行一周的适应性喂养,随机分为5组。2.实验分组及处理措施实验前禁食2小时,先分别给各组大鼠称量体重,然后根据人临床用量(猪牙皂生药量1.5g.60kg.d-1)、人与大鼠的等效剂量倍数,增加至6倍作为皂荚提取物低剂量组的实验用量,按1:2:4,将60只雄性大鼠随机分为6组,即:皂荚提取物低剂量(0.15g.kg.d-1)组、皂荚提取物中剂量(0.3g.kg.d-1)组、皂荚提取物高剂量(0.6g.kg.d-1)组、索拉非尼组:0.08g/kg/d(索拉非尼成人0.8g/d,按人与大鼠体表面积折算的等效剂量计算,0.8g×7/70=0.08g/kg/d);空白对照(E)组:0.9%生理盐水10 ml/kg/d对正常大鼠进行灌胃;模型组:0.9%生理盐水10ml/kg/d对肝癌大鼠进行灌胃。每天实行等时(14:30)等对各组大鼠进行灌胃一次,每周连续灌胃6次,周日测大鼠体重,然后再根据体重调整剂量,各组连续给药30天。3.实验步骤3.1 MVD实验步骤:解剖实验大鼠,取出肝脏组织,并以4%的甲醛溶液固定,修剪组织并冲洗后经梯度酒精脱水,常规石蜡包埋切片(片厚6μm)、以鼠抗-CD34(1:50)为第一抗体,En Vision(rat)为第二抗体(均购于Abcam公司,货号:Ab185732)进行免疫组织化学染色。根据Weidner校正方法,先用低倍镜(×10)在每一个标本先下选取热点(5个微血管数最多的区域),然后在每一个热点中计算一个高倍镜(×40)下的微血管数目,取其平均值为MVD值[3]。3.2实验分为空白组、模型组、皂荚提取物低剂量组、皂荚提取物中剂量组、皂荚提取物高剂量组、索拉菲尼组6组。采用蛋白印迹法和实时荧光定量PCR法分别检测各组VEGF、HIF-1α、PI3K、AKT、m TOR的表达。3.3实验分为空白组、模型组、皂荚提取物低剂量组、皂荚提取物中剂量组、皂荚提取物高剂量组、索拉菲尼组6组。分别进行各组大鼠的肝脏病理切片的检测和一般形态学的观察。4.统计学处理应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计学处理。两组间比较用t检验,三组间比较采用方差分析,观察指标采用x±s表示,P<0.05为差异有统计学意义。三、实验结果1.不同组别的肝癌组织中MVD的表达实验结果显示,各个组别与空白组比较,MVD值均有明显的增加(P<0.01);各个给药组与模型组相比较,MVD值均有明显的下降(P<0.01)。此结果表明MVD在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予药物治疗后,大鼠肝癌组织趋于好转,MVD也有所下降,提示MVD与肝癌的生长、浸润、预后密切相关。同时各个给药组之间MVD的变化没有明显的差异(P>0.05),提示皂荚提取物与索拉菲尼均可防治原发性肝癌,且二者的效果差异不大。2.蛋白印迹法检测皂荚提取物对肝癌大鼠HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、m To R表达的影响2.1不同组别对AKT分子表达的影响其它各个组别分别与空白组和模型组比较,AKT的表达都有明显的统计学意义(P<0.01);皂荚提取物低剂量组和中剂量组AKT与索拉菲尼组比较、皂荚提取物中剂量组和皂荚提取物高剂量组AKT与皂荚提取物低剂量组比较有统计学意义(P<0.05);其他组之间没有明显的差异(P>0.05)。此结果表明AKT在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,AKT也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与AKT的表达密切相关。结论提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌中AKT表达的效果比较显著,且二者的效果差异不大。2.2不同组别对PI3K分子表达的影响皂荚提取物中低剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物中高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和中剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);空白组与皂荚提取物高剂量组比较、皂荚提取物低剂量组与模型组比较、皂荚提取物中剂量组与皂荚提取物低剂量组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明PI3K在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,PI3K也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与PI3K的表达作用密切。此结论提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌PI3K表达的效果比较显著,且二者的效果差异不大。2.3不同组别对m To R分子表达的影响皂荚提取物各剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物中高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和中剂量组m To R与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);模型组与皂荚提取物低剂量组的m To R比较、索拉菲尼组与皂荚提取物高剂量组比较、皂荚提取物中剂量组与低剂量组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明m To R在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,m To R也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与m To R的表达密切相关。同时结论也提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌中m To R表达的效果比较显著,且二者的效果差异不大。2.4不同组别对HIF-1α分子表达的影响皂荚提取物各剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物中高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量和中剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);模型组与皂荚提取物低剂量组比较、索拉菲尼组与皂荚提取物中剂量组比较、空白组与索拉菲尼组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明HIF-1α在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,HIF-1α也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与HIF-1α的表达密切相关。同时此结论提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌中HIF-1α表达的效果比较显著,且二者的效果差异不大。2.5不同组别对VEGF分子表达的影响皂荚提取物中低剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物中高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和中剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);模型组和皂荚提取物中剂量组与皂荚提取物低剂量组比较、索拉菲尼组与皂荚提取物中剂量组比较、索拉菲尼组和皂荚提取物高剂量组与空白组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明VEGF在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治后,VEGF也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与VEGF的表达密切相关。同时此结论提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌中VEGF表达的效果比较显著,且二者的效果差异不大。3.PCR法检测皂荚提取物对肝癌大鼠HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT、m To R表达的影响3.1不同组别对AKT分子表达的影响皂荚提取物中低剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和中剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);皂荚提取物高剂量组与空白组比较、模型组与皂荚提取物中剂量组比较、索拉菲尼组与皂荚提取物高剂量组比较、皂荚提取物中剂量组与低剂量组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明AKT在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,AKT也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与AKT的表达作用密切。同时此结论也提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌AKT表达的效果比较显著,且二者治疗原发性肝癌效果的差异不显著。3.2不同组别对PI3K分子表达的影响皂荚提取物中低剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和中剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);皂荚提取物高剂量组与空白组比较、模型组与皂荚提取物中剂量组比较、皂荚提取物中剂量组与皂荚提取物低剂量组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明PI3K在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,PI3K也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与PI3K的表达作用密切。此结论同时也提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌PI3K表达的效果比较显著,可以更好地防治原发性肝癌,且二者的效果差异不大。3.3不同组别对m To R分子表达的影响皂荚提取物中低剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物中高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和中剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);空白组与高剂量组比较、模型组与低剂量组比较、皂荚提取物中剂量组与皂荚提取物低剂量组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明m To R在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,m To R也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与m To R的表达作用密切。此结论同时也提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌m To R表达的效果比较显著,可以更好地防治原发性肝癌,且二者的效果差异不大。3.4不同组别对HIF-1α分子表达的影响皂荚提取物高中低剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物中高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);空白组和中药中剂量组与索拉菲尼组比较、中药中剂量组与中药低剂量组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明HIF-1α在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,HIF-1α也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与HIF-1α的表达密切相关。此结论同时也提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌中HIF-1α表达的效果比较显著,且二者的效果差异不大。3.5不同组别对VEGF分子表达的影响皂荚提取物高中低剂量组和模型组与空白组比较、皂荚提取物高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和中剂量组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01);空白组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物中剂量组与模型组比较、皂荚提取物高低剂量组与皂荚提取物中剂量组比较均有统计学意义(P<0.05)。此结果表明VEGF在肝癌大鼠组织中明显高于正常组;当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,VEGF也有不同程度下降,提示肝癌的生长、浸润、预后与VEGF的表达密切相关。此结论同时也提示皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼在降低原发性肝癌中VEGF表达的效果比较显著,且二者的效果差异不大。4.大鼠肝脏病理切片和一般形态学观察4.1皂荚提取物及索拉菲尼各组对大鼠一般情况的影响空白组:大鼠行动自如;体格健壮;反应敏捷;呼吸平稳;毛发整洁光亮;目光有神;饮食正常。模型组:大鼠行动不便,个别步履蹒跚;目光呆滞;体格瘦小;反应明显迟钝,对周围环境的刺激没有响应;呼吸微弱;口角流涎;肌肉僵硬或萎缩;毛发稀疏;饮食减少;身体蜷缩,抱成一团。低剂量组:大鼠行动不便,步履蹒跚;体格瘦小;目光呆滞;反应迟钝,对周围环境的刺激响应不及时;呼吸微弱或急促;口角流涎;肌肉萎缩;毛发松散;饮食较少;身体蜷缩,抱成一团。中剂量组:大鼠行动好转,步履偶尔蹒跚;目光呆滞有所好转;反应稍慢,对周围环境的刺激响应不及时;呼吸微弱或急促;口角流涎减轻;肌肉萎缩或僵硬;毛发稀疏;饮食增加。高剂量组:大鼠行动自如,和正常组没有明显区别;体格健壮;目光有神;反应稍有迟钝,对周围环境的刺激基本能够及时做出回应;呼吸基本平稳;口角无流涎;肌肉丰满,收缩自如;毛发增加;饮食增加。索拉菲尼组:大鼠体格健壮,行动自如,和正常组没有明显区别;目光有神;反应敏捷,对周围环境的刺激基本能够及时做出回应;呼吸基本平稳;口角无流涎;肌肉丰满,收缩自如;毛发整洁光亮;饮食增加。4.2皂荚提取物及索拉菲尼各组对大鼠体重的影响模型组和皂荚提取物低剂量组与空白组比较、皂荚提取物高剂量组和索拉菲尼组与模型组比较、皂荚提取物低剂量组和模型组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高剂量组与皂荚提取物低剂量组比较发现均有一定的统计学意义(P<0.05);皂荚提取物高、中剂量组和索拉菲尼组与空白组比较、皂荚提取物中剂量组和皂荚提取物低剂量组与模型组比较、皂荚提取物高中剂量组和空白组与索拉菲尼组比较、皂荚提取物高低剂量组与皂荚提取物中剂量组相比较发现有明显的差异(P>0.05);此结果表明肝癌大鼠的体重明显低于正常组,当给予不同类型和浓度的药物进行治疗后,大鼠的体重也有不同程度的升高。此结论同时也提示原发性肝癌大鼠经过药物治疗后,皂荚提取物高剂量组与索拉菲尼对大鼠体重影响比较明显,且二者的效果差异不大。4.3各组大鼠肝脏病理切片观察正常组:肝小叶结构清晰完整,细胞胞浆胞核均匀,肝细胞索排列整齐,以中央静脉为中心呈放射状排列。胞核较大,位于肝细胞中央,整个状态均一。肝窦内及汇管区可见少量淋巴细胞浸润,无纤维组织增生。模型组:肝小叶失去正常结构,大部分肝小叶被肿瘤组织代替,周边的肝小叶受压质地变实,肝窦扩张,肝血窦周围可见纤维组织增生。汇管区明显增宽,有大量的成纤维细胞、纤维细胞。肿瘤细胞呈圆形,再生活跃,异型性明显,细胞核染色变深,核质比变大,部分出现核固缩和核碎裂现象,肿瘤细胞呈团块状分布,有的部分出现凝固性坏死,染色呈深红色。中药低剂量组:相对于模型组,肝小叶失去正常结构,一部分肝小叶被肿瘤组织取代;细胞形态有些许的改善,但是依然出现很严重的核固缩现象,核质比很大,部分细胞呈团块状。肝窦扩张,肝血窦周围有纤维组织增生。中药中剂量组:相对于模型组,有较大程度的改善,可明显看出肝小叶的结构有了一定的恢复,肿瘤组织、异型性细胞数量和过塑细胞数量减少,核质比较大的细胞数量也明显减少。肝血窦周围偶尔可见到纤维组织增生。中药高剂量组:从形态上来看,肝小叶结构基本清晰完整,细胞胞浆胞核均匀,大部分肝小叶细胞正常,部分细胞有核固缩和异型性的现象,但是相较于模型组,状态改善很明显。肝血窦周围很少见到纤维组织增生。索拉菲尼组:肝小叶结构基本清晰完整,细胞胞浆胞核均匀,肝细胞索排列整齐,以中央静脉为中心呈放射状排列。胞核较大,位于肝细胞中央,整体分布较均一。肝窦内及汇管区可见少量淋巴细胞浸润,基本没有纤维组织增生。与正常组相比,有很少部分细胞的形态出现异型性,无团状分布现象。四、结论1.皂荚提取物各剂量组和索拉菲尼对肝癌大鼠的肿瘤细胞均具有抑制作用,其中皂荚提取物高剂量组和索拉菲尼组的抑制效果最为明显,且二者之间没有明显的差异;皂荚中低剂量组次之,空白组和模型组没有抑制作用。2.皂荚提取物抑制大鼠原发性肝癌的机理,从PI3K/AKT/m TOR信号通路、VEGF和HIF-1α的表达得到验证,各个信号都有其相应的表达(在PCR和westernblot方法中,皂荚提取物和索拉菲尼均可以使PI3K、AKT、m TOR、VEGF和HIF-1α的表达下调,其中皂荚提取物高剂量组和索拉菲尼下调上述五个基因的效果最为显著,二者之间没有明显的差异)。