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研究目的:1、体外分离培养、纯化并鉴定人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。2、研究hAMSCs对异基因混合淋巴细胞反应(MLR)体系中淋巴细胞增殖及相关细胞因子的影响。研究方法:1、采用酶消化法从羊膜分离出hAMSCs,进行传代培养、逐步纯化,流式细胞仪检测细胞表面标志,并通过条件培养基定向诱导,最后根据形态学、生物学特征、细胞表面标志以及分化潜能鉴定hAMSCs纯度。2、建立双向MLR体系,加入丝裂霉素处理过的不同比例的hAMSCs,用3H掺入法测定淋巴细胞增殖率并用ELISA法测定混合培养上清液中白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量,观察hAMSCs对淋巴细胞增殖和相关细胞因子的影响。研究结果:1、从羊膜中分离的细胞接种24小时后便有少量的细胞贴壁,经1周后逐渐形成扁平单层细胞,呈漩涡状生长或成簇生长,随着细胞密度的增加,胞体变得细长,形态类似成纤维细胞。培养的细胞可以稳定生长传代,而且体外培养10代以后,细胞的增殖速度无明显减慢。2、hAMSCs的原代细胞在接种后2~8天后进入对数生长期,相差显微镜下观察细胞突起向周围伸展,出现两个核细胞分裂相的hAMSCs多见,细胞密度增大,彼此相连;11~14天进入平台期,hAMSCs铺满瓶底,细胞扩增趋缓,原代培养结束。hAMSCs传代后P3代和P15代的生长曲线显示,随着hAMSCs的逐渐纯化,细胞倍增速度基本稳定。传代后6~12小时,相差显微镜下即可观察到细胞贴壁;2~4天后进入到对数生长期,扩增速度明显快于原代培养;6~7天即可铺满培养板底。3、hAMSCs表达有BMSCs相似的表面标志,流式细胞仪检测显示,hAMSCs表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45、HLA-DR和CD106。4、hAMSCs向神经细胞诱导24h后,细胞形态明显改变,胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,染色可见兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)和兔抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性。hAMSCs向成骨细胞诱导分化2周后,细胞形态由纺锤形转变为多角形,染色可见I型胶原阳性;3～4周后可见钙结节形成。5、用3H-TdR掺入法对淋巴细胞增殖进行检测。hAMSCs以不同的hAMSCs /外周血单个核细胞(PBMC)比例加入MLR体系共同培养后,各组cpm值均较培养前明显下降(P均<0.05);hAMSCs /PBMC比例为1?5和1?10的两组,其增殖抑制率均明显强于1?500组(P均<0.05)。6、hAMSCs与未经活化的淋巴细胞混合培养( PBMC1+hAMSCs组、PBMC2+hAMSCs组)时,培养上清中的IL-2、IFN-γ水平与单独淋巴细胞培养(PBMC1组或PBMC2组)上清中的水平无明显变化(P均>0.05);hAMSCs加入MLR体系(PBMC1+ PBMC2+hAMSCs组)中培养时,细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌均明显低于单纯MLR体系(PBMC1+PBMC2组)中的量(P<0.05)。研究结论:1、体外可以分离培养hAMSCs,hAMSCs具有与BMSCs相似的细胞生物学特性以及多向分化潜能。2、hAMSCs可以抑制MLR体系中淋巴细胞的增殖,呈剂量依赖性;并可下调MLR体系中IL-2和IFN-γ水平,对同种异体免疫反应具有负调节作用,为日后临床联合应用MSCs和造血干细胞移植以预防和治疗移植物抗宿主病(GVHD)提供理论基础。3、hAMSCs可以作为间充质干细胞(MSCs)基础及临床应用研究的全新来源。