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蛋白酶是催化蛋白质或多肽中肽键水解的专一性酶。鉴于蛋白质序列空间巨大,水解系统所需的酶系复杂,Carlos López-Otín等将有关蛋白酶的研究作为蛋白质组学中独特子集的概念提出,并命名为“降解组学”。相关研究重点关注蛋白酶的底物特异性识别与水解机制,如消化系统中胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等位点特异性蛋白酶的协同降解与泛素-蛋白酶体系统对胞内复杂底物的精准降解等。有限的蛋白酶系以何种方式识别并高效水解近乎无限的底物蛋白序列是目前研究亟待解决的热点问题。放线菌分泌的蛋白酶具有良好的稳定性与催化活性,在蛋白类生物质废弃物的降解转化中发挥重要作用。其中糖多孢菌属与糖单孢菌属在高氮菌渣发酵生境中大量出现,具有高效的蛋白降解能力。选择其中最具代表性的模式菌株红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea NRRL 2338 与绿色糖单孢菌Saccharomonospora viridis DSM 43017,系统、全面地解析其在蛋白降解过程中功能酶系的时序表达与不同蛋白酶组分间的协同作用机制,从而可针对特定底物精准定制高效降解酶系,为提高蛋白类生物质的转化效率与绿色可持续利用提供理论依据。本文以红色糖多孢菌与绿色糖单孢菌为研究对象,通过比较基因组学、转录定量分析、蛋白质组学等降解组学的技术与结构蛋白组学的方法,初步构建了菌株蛋白酶高效降解系统,取得的主要进展如下:1.对红色糖多孢菌与绿色糖单孢菌进行比较基因组学分析,解析了关键蛋白酶家族及其底物特异性识别模式。红色糖多孢菌基因组中包含了分属于44个家族与50个亚家族的172个蛋白酶基因,约占菌株蛋白编码序列的2.39%;绿色糖单孢菌基因组中包括归类于35个家族与39个亚家族的91个蛋白酶基因,内肽酶与外肽酶种类齐全,对蛋白类底物具有高效降解潜能。二者所编码的胞外蛋白酶主要由S1-A、S8-A家族丝氨酸内肽酶,M23家族金属内肽酶,M1、M28-A、S15家族氨肽酶与M14-A、M14-B、M15-A家族羧肽酶成员组成,它们是蛋白酶高效降解系统中的关键功能酶系。对MEROPS数据库中收录的不同家族与亚家族底物专一性信息进行统计,绘制相关底物序列谱。基于底物序列在P4-P4’位点处总熵值与保守性的不同解析了各家族与亚家族蛋白酶的特异性识别模式,并在Weblogo中作可视化分析。如S1-A家族胰蛋白酶等成员特异性识别P1位的Arg或Lys,M23家族金属内肽酶偏好降解P1位Gly处的肽键;M28-A家族氨肽酶特异性释放N端P1位的Leu、Phe等氨基酸残基,S15家族脯氨酸氨肽酶特异性识别P1位的Pro,M14-B家族金属羧肽酶特异性水解P1’位的Arg或Lys等。而S8-A家族丝氨酸内肽酶与M1家族氨肽酶呈现出非特异性的识别方式,在P1-P1’处广泛水解疏水氨基酸所形成的肽键。各家族与亚家族蛋白酶底物特异性识别模式的解析为菌株蛋白酶高效降解系统的构建提供了新的思路。2.基于降解组学分析阐明了红色糖多孢菌与绿色糖单孢菌蛋白酶系的组成与时序表达,结合不同家族蛋白酶特异性识别模式,构建菌株蛋白质高效降解代谢网络。选择氨基酸组成各异的酵母提取物、水溶性玉米蛋白粉、酪蛋白氨基酸与明胶作底物对红色糖多孢菌进行摇瓶培养。通过转录定量分析、蛋白质组学等方法明确了关键蛋白酶酶系的组成与表达时序性,发现同一微生物菌株,诱导底物虽然不同,但胞外酶系的动态表达规律基本一致:以S1-A、S8-A为主的丝氨酸内肽酶首先被分泌,位点特异性水解P1位Arg、Lys或P1-P1’位疏水氨基酸所形成的肽键,将序列空间复杂的蛋白质降解为肽段;其次大量分泌的M28-A家族氨肽酶特异性识别肽链N端Leu、Phe等氨基酸,形成更小的肽段,而特异性识别P1位Pro或Ala的S15家族氨肽酶最后分泌,降解含Pro等难降解的小肽;后期氨肽酶、羧肽酶大量出现,M14-B家族金属羧肽酶特异性识别由S1-A家族丝氨酸内肽酶切割后C端为Arg或Lys的肽段;此外,M7、M23家族金属内肽酶、M24-A家族氨肽酶与M15-A家族羧肽酶特异性识别肽链中Gly、Ala等位点,与M1家族非特异性氨肽酶共同将肽链进一步水解为寡肽及部分氨基酸。大量肽转运蛋白的确定证实了红色糖多孢菌能够吸收相关肽段,并通过胞内S9-A、S9-B等家族氨肽酶与S10、S13等家族羧肽酶高效协同的方式快速降解转化以供菌体吸收利用。与直杆糖多孢菌蛋白质组数据比较分析,初步确定了糖多孢菌属中蛋白酶高效降解系统作用于球蛋白等可溶蛋白底物时的规律普适性。绿色糖单孢菌分泌的蛋白酶系,主要包括S8-A、S1-A、S45、M23、C40等家族内肽酶与M1、M17、M28-A、S15、S9-C等外肽酶,关键酶系的组成与协同降解模式与红色糖多孢菌蛋白酶高效降解系统基本一致。富含Gly的水溶性玉米蛋白粉作底物时,可诱导S45家族的大量表达,S45家族丝氨酸内肽酶特异性识别P1位的Gly,在胞外与M23家族金属内肽酶共同靶向肽链中Gly后的肽键,使水溶性玉米蛋白粉成为菌株最适底物。进一步结合Alphafold2对关键家族蛋白酶进行模建,对活性架构的大小、形状以及带电性质进行分析发现,S1-A、S8-A等家族同工酶均具有不同的表面性质,活性架构处表面电势的多样性意味着它们偏好结合的底物是多样且有差异的,为蛋白酶系的协同降解奠定了结构基础。3.分析多种微生物的降解组组成,初步阐明了微生物蛋白酶高效降解系统中关键家族的组成与协同降解模式等共性规律。与多数糖苷水解酶受不同种类的底物特异性诱导不同,微生物胞外蛋白酶的诱导表达谱基本一致。对Bacillus sp.CN2、Streptomyces sp.F-3、S.erythraea NRRL 2338、S.recrtivirgula、S.viridis DSM 43017的胞外蛋白酶组成与分泌次序进行比较分析,结果发现微生物在降解复杂球状蛋白底物时首先分泌S1-A与S8-A家族丝氨酸内肽酶,其次分泌特异性识别多肽链中的Leu等氨基酸残基的M4家族金属内肽酶、M28-A家族氨肽酶,S15家族脯氨酸二肽酶后期分泌,特异性识别肽链中难降解的Pro。红色糖多孢菌与绿色糖单孢菌等放线菌编码了 M14-A、M14-B、M15-A等位点特异性外肽酶,与M1家族非特异性氨肽酶共同构成复杂的蛋白酶水解系统,可完整降解球状蛋白;而芽孢杆菌胞外功能酶系仅由S1-A、S8-A与M4家族成员组成,无S15家族等相关酶类,降解后仍存在大量肽段。此外,M23等家族金属内肽酶在红色糖多孢菌等放线菌中常常出现,进一步协同降解多肽片段形成寡肽与氨基酸,经肽转运蛋白转运至胞内由大量氨肽酶、羧肽酶完成降解与吸收利用。