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背景和目的原发性肝癌为全球常见的恶性肿瘤之一,肝癌治疗的预后差与其高转移性密切相关。越来越多的研究证实,肿瘤细胞中存在一些具有自我更新能力的特殊亚群,称为肿瘤干细胞或肿瘤启始细胞,肿瘤干细胞具有维持和促进肿瘤生长的特性,可能是肿瘤发生、转移、复发、治疗抵抗的根源。CD133是由PROM-1基因编码的5次跨膜糖蛋白,作为分离培养和鉴定肝癌干细胞的特异性标志之一。CD133+肝癌细胞在自我更新、增殖、分化、成瘤、放化疗抵抗等方面均表现出干细胞的特性,CD133还与肿瘤的恶性进展、预后及复发率密切相关。上皮间质转化是上皮细胞在某些基因和特定环境作用下转化为具有间质细胞表型的生物学过程,其在胚胎发育、肿瘤发展以及肿瘤转移等过程中发挥了重要作用。目前研究证实,上皮间质转化和肿瘤干细胞之间有着密切的关联,肿瘤细胞经过上皮间质转化可表现出肿瘤干细胞的特性。超声靶向微泡破坏作为一种新型的基因传输方法及靶向给药系统备受关注,它可以成功地将RNA干扰技术和声脉冲、超声等技术相结合,提高局部组织、细胞的基因转染导入效率和靶向性,有望成为一种安全、简便、高效的基因治疗方法。本研究的目的在于探讨超声靶向微泡介导sh RNA对CD133+肝癌干细胞进行基因转染的可行性,并且比较不同转染方式的基因转染效率差异;研究超声靶向微泡介导CD133-sh RNA转染后对CD133+肝癌干细胞生长、增殖、侵袭能力以及成瘤能力影响;研究超声靶向微泡介导CD133-sh RNA转染对CD133+肝癌干细胞上皮间质转化调控的分子机制。方法1.培养SMMC-7721肝癌细胞,通过流式分选CD133+SMMC-7721肝癌细胞,检测分选前后CD133表达情况;通过成球试验、CCK-8增殖实验、成瘤实验鉴定分选的肝癌干细胞;2.将分选的CD133+SMMC-7721肝癌干细胞分为三组:对照组(Control),质粒+脂质体组(P+L);质粒+超声辐照微泡组(P+UTMD)分别按条件进行转染,荧光显微镜观察转染后荧光表达情况,流式细胞术检测转染率,以及荧光定量PCR(q RT-PCR)、Western Blot方法检测转染后各组细胞CD133 m RNA和蛋白的表达。3.通过q RT-PCR检测转染后各组肝癌细胞中干细胞相关基因CD44、CD90、Oct4、Sox2的表达情况;成球试验检测各组细胞的自我更新能力;CCK-8、克隆形成实验检测各组肝癌细胞增殖及克隆形成能力;利用流式细胞仪检测各组细胞凋亡的变化;Transwell侵袭及迁移实验检测细胞的侵袭及迁移能力的变化;构建裸鼠移植瘤模型,将转染各组细胞注入随机分组裸鼠皮下,观察裸鼠移植瘤的生长情况。4.q RT-PCR、Western blot检测各组细胞中上皮细胞标志物(E-cadherin蛋白)和间叶细胞标志物(N-cadherin和vimentin蛋白)的表达情况,免疫组化检测裸鼠瘤组织上述EMT标记物的表达情况;Western blot检测NF-κB通路表达情况。结果1.利用流式分选技术成功从SMMC-7721肝癌细胞系中分选出CD133+肝癌干细胞。流式分选检测结果显示,分选前SMMC-7721肝癌细胞中的CD133+细胞比例为0.2-2%,分选后CD133+细胞的比例可达90%;CD133+肝癌干细胞在干细胞条件培养基悬浮培养条件下成团生长,数量变多,体积变大。成球实验,CCK-8增殖实验和裸鼠成瘤实验表明,CD133+SMMC-7721肝癌干细胞有较高的成球能力、增殖能力及成瘤能力。2.荧光显微镜下观察结果发现,CD133-sh RNA转染后,超声微泡转染组细胞与脂质体转染组相比,有较强的荧光表达;流式细胞仪定量检测各转染组的转染效率结果显示,超声微泡转染组转染效率高于脂质体转染组(P<0.05);q RT-PCR和Western Blot结果显示,超声微泡转染组CD133表达低于脂质体转染组和对照组(P<0.05)。3.q RT-PCR结果显示,超声微泡转染组细胞干细胞相关基因CD44、CD90、Oct4、Sox2的m RNA水平低于脂质体转染和对照组(P<0.05);成球实验、CCK-8及细胞克隆形成实验表明,超声微泡组转染细胞的自我更新能力、增殖及克隆形成能力低于脂质体转染组和对照组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,超声微泡转染组细胞的凋亡率增高(P<0.05)。Transwell实验和裸鼠移植瘤实验结果表明,超声微泡转染组细胞的迁移、侵袭能力及成瘤能力低于脂质体转染和对照组(P<0.05)。4.q RT-PCR、Western blot和免疫组化结果显示,超声微泡转染组与脂质体转染组及对照组相比,上皮细胞标志物E-cadherin蛋白升高,而间叶细胞标志物N-cadherin和vimentin蛋白表达降低(P<0.05);另外,通过Western Blot检测了NF-κB经典通路IKKβ/IκBα/Rel A及p-IKKβ、p-IκBα、p-Rel A蛋白的表达,发现超声靶向微泡介导CD133-sh RNA转染肝癌干细胞后p-IKKβ、p-IκBα、p-Rel A表达均降低(P<0.05)。结论1.CD133+SMMC-7721细胞具有较强的成球、增殖能力及体内成瘤能力,是具有肿瘤干细胞特性的肝癌细胞亚群。2.超声靶向微泡破坏介导的CD133-sh RNA转染后能显著下调CD133+肝癌干细胞CD133的表达,并抑制其增殖、侵袭及成瘤能力。3.超声靶向微泡破坏介导的CD133-sh RNA转染后CD133+肝癌干细胞发生了上皮间质转化的逆转,NF-κB经典信号通路可能参与介导了肝癌干细胞恶性程度变化及上皮间质转化过程。4.CD133在调控CD133+肝癌干细胞生物学特性、侵袭能力及上皮间质转化等方面发挥了重要作用。5.超声靶向微泡破坏介导的CD133下调可能为肝癌干细胞的靶向治疗提供理论基础和潜在的治疗手段。