棉花RabA类基因的抗旱耐盐功能初步分析

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植物在生长过程中,往往会遭受生物胁迫和非生物胁迫,其中,干旱胁迫和盐胁迫是危害植物生长发育的两个主要胁迫因素。且干旱、半干旱地区和盐碱地区面积逐渐扩大。棉花是重要的经济作物,因此,发掘抗旱、耐盐棉花重要基因资源,解析这些基因的抗旱、耐盐机制,进而改良现有品种抗旱、耐盐性状,培育耐逆新品种(系)是棉花研究的一个重要内容。Rab蛋白是小G蛋白中成员最多的一个蛋白亚家族,在生物胁迫及非生物胁迫中起关键作用。植物中的Rab基因包含A-H八个亚组,其中RabA类基因在植物中存在显著扩增的现象,可能与植物特有的生活模式有关,在植物对抗不良环境中起着重要的作用。本研究拟在陆地棉中,挖掘抗旱、耐盐候选RabA类基因,进而对候选基因进行初步抗旱、耐盐功能分析,为进一步系统的研究这些RabA基因的功能奠定基础。主要结果如下:1.抗旱、耐盐RabA类基因的筛选及候选基因的获得:我们开展了陆地棉RabA类基因全基因组的鉴定及分类工作。在陆地棉遗传标准系TM-1中共鉴定到66个RabA类基因,66个GhRabA及26个AtRabA基因的聚类分析,结果可以把RabA类基因分为六个亚组(A1-A6),其中A1、A2、A4和A5包含的RabA基因较多,A3和A6包含的RabA基因较少。对66个GhRabA类基因盐、旱诱导表达模式进行分析,发现RabA基因盐胁迫和旱胁迫的诱导模式较为一致,受诱导的时期和表达特征相同。根据胁迫诱导表达热图选取受诱导时期较多的基因,结合组织器官表达模式,选取组成型表达及在营养器官中优势表达的基因,得到八对GhRabA类基因GhRabA 1a、GhRabA1b、GhRabA1h、GhRabA2a、GhRabA2b、GhRabA3b、GhRabA4f 和 GhRabA5d,为棉花RabA类抗旱、耐盐候选基因。进一步对这八对RabA类基因氨基酸数目、蛋白质分子量、等电点、亚细胞定位等进行了统计及预测工作。基本生物信息学分析都与Rab基因的基因特征是一致的。亚细胞定位预测结果均显示位于高尔基体,这可能与Rab基因参与细胞的囊泡运输机制有关。2.候选基因逆境诱导表达的定量验证:以15%的PEG-6000及300mM的NaCl处理下不同时期(0h,6h,12h,24h,48h,72h)TM-1根为模板,对八对RabA类基因的抗旱、耐盐诱导表达模式进行定量PCR验证。结果表明:四个RabA基因(GhRabAla、GhRabA1b、GhRabAlh、GhRabA5d)在 PEG 诱导后呈显著上调变化,五个候选 RabA 基因(GhRabA1b、GhRabAlh、GhRabA3b、GhRabA4f、GhRabA5d)在NaCl诱导后呈显著上调变化。3.四个抗旱候选RabA类基因的抗旱性验证。于PEG处理15d后观察植株表型,发现沉默候选基因植株都出现了对旱胁迫敏感的表型。与TRV:00相比,PEG处理下的TRV:GhRabA1a植株株高、POD活性有显著差异,PRO含量有极显著差异;TRV:GhRabAlb、TRV:GhRabA1h的H2O2含量有显著差异,MDA含量、PRO含量有极显著差异,TRV:GhRabA1b株高、POD活性有显著差异,TRV:GhRabA1h株高有极显著差异,SOD活性有显著差异;TRV:GhRabA5d株高、H2O2含量、PRO含量有极显著差异,地上干物重、MDA含量有显著差异。4.五个耐盐候选RabA类基因的耐盐性验证。于NaCl处理30d后观察植株表型,发现沉默候选基因植株都出现了对盐胁迫敏感的表型。与TRV:00相比,在NaCl处理组中,TRV:GhRabA1b植株株高、地下干物重及PRO含量有显著性差异;TRV:GhRabA1h、TRV:GhRabA3b,TRV:GhRabA4f植株地下干物重、PRO 含量、有极显著差异,H2O2含量、POD活性有显著差异,TRV:GhRabA3b、TRV:GhRabA4f植株株高有显著差异,TRV:GhRabA3b植株MDA含量有显著差异;TRV:GhRabA5d植株株高显著降低,地下干物重极显著降低。综上所述,GhRabA1a、GhRabA1b、GhRabA1h及GhRabA5d四个基因在棉花抗旱中起到作用,四个候选抗旱RabA基因中,沉默GhRabA1b、GhRabA1h基因棉花植株旱敏感表型更加明显,GhRabA5d基因沉默后棉花植株生长遭受抑制。GhRabA1b、GhRabA1h、GhRabA3b、GhRabA4f及GhRabA5d五个基因在棉花耐盐中起到作用,五个候选盐 RabA基因中,沉默GhRabA1h、GhRabA3b、GhRabA4f基因棉花植株盐敏感表型更加明显,同样的,GhRabA5d基因沉默后棉花植株生长遭受抑制。本研究为棉花抗逆挖掘了基因资源。
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