RNA干扰(RNA interference,RNAi)的作用机制目前基本清楚,细胞内的RNaseⅢ类的Dicer蛋白识别并切割ds RNA(double-stranded RNA),产生小分子干扰si RNA RNA(small interfering RNA)等非编码小分子RNA,Argonaute(AGO)蛋白随即结合这些小分子RNA,将其装配为RNA诱导的沉默复合体(RNAinduced silencing complex,RISC),RISC特异性降解与小分子RNA序列匹配的靶RNA,或抑制靶RNA的翻译途径,最终达到沉默靶基因的目的。目前已有大量研究发现,在植物、昆虫等低等生物中,RNAi作为一种重要的抗病毒免疫机制发挥关键作用。针对于宿主这种特异的免疫方式,一些植物和昆虫病毒进化获得了拮抗宿主RNAi免疫的功能元件VSR(viral suppressor of RNA silencing),能够有效抑制基于RNAi的抗病毒免疫(RNA-based virus immunity,RVI),实现病毒滋生的感染和传播。哺乳动物可通过干扰素等天然免疫系统对抗病毒感染,尽管已有研究发现RNAi通路的存在,但哺乳动物细胞能否利用RNAi对抗病毒感染尚缺乏足够证据。日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属于黄病毒科黄病毒属,是一种以库蚊为传播媒介的虫媒病毒。临床上可以引起严重的脑炎症状和神经系统疾病,对人类健康和公共卫生构成严重威胁。其基因组是长约为10976 bp的单股正链RNA,包含两端的非编码区和一个单一的开放读码框,分别编码3个结构蛋白以及7个非结构蛋白。作为虫媒病毒,其天然宿主既包括昆虫也包括哺乳动物,是研究RNAi免疫通路的理想材料。日本脑炎病毒在哺乳动物宿主中拮抗经典的干扰素免疫通路研究已经取得较大进展,而其在昆虫或者哺乳动物中拮抗RNAi免疫的研究还处于起步阶段。发现并确认病毒的VSR对深入认识病毒感染的分子机制具有重要意义,也可进一步以此为工具证明哺乳动物体内存在RNAi抗病毒免疫机制。本研究首先通过真核表达和体外生化等手段对日本脑炎病毒的全部蛋白拮抗RNAi的功能进行了深入分析,发现NS2A具有拮抗RNAi的功能;进一步通过生物信息学和反向遗传学技术,分析了NS2A蛋白上可能与RNA具有相互作用的位点,并构建了相应的突变病毒,对其生物学特征进行了初步评价。本研究的内容包括如下两个部分:一、日本脑炎病毒VSR的筛选与功能研究目前,已知的VSR基本为病毒自身编码的蛋白,如弗洛克豪斯病毒(Flock house virus,FHV)的B2蛋白。在蚊虫细胞中,外源加入EGFP的ds RNA/si RNAs可导致EGFP的m RNA降解,而FB2可以保护EGFP的基因组不受到RNAi作用的影响。本部分研究首先在上述系统中共转染重组表达的日本脑炎病毒的10个蛋白,确定了日本脑炎病毒的NS2A蛋白与FB2具有相类似的功能,可以保护EGFP的m RNA不受到细胞内RNAi通路的降解。随后,敲除该系统中RNAi通路中的关键作用蛋白,以Northern blot的方法进一步证明了日本脑炎病毒的NS2A蛋白与ds RNA/si RNAs相互作用来发挥VSR的功能,并以此确定了NS2A蛋白是日本脑炎病毒的VSR。由于NS2A蛋白可能与ds RNA/si RNAs结合,而RNA为带负电分子,因此推测NS2A蛋白上的正电荷氨基酸可能起到了关键性的作用。随后,我们通过生物信息学的方法比对不同的黄病毒NS2A蛋白序列,发现其中的大部分正电荷氨基酸都非常保守,并且在一定区域存在多个正电荷氨基酸聚集的现象,这些正电荷氨基酸很有可能发挥重要作用。进一步研究通过ITASSER蛋白预测网站的数据分析,推测出NS2A蛋白的可能折叠方式,并利用Py MOL软件进行蛋白表面位点分析,发现正电荷氨基酸位点基本在蛋白跨膜区以外的折叠连接处。因此,我们推测K26、T33、K84、R98、R140、R163、R171、K193、K226这9个氨基酸可能是影响NS2A蛋白发挥VSR作用的关键位点。二、日本脑炎病毒VSR缺陷型病毒的构建与生物学特征分析根据上述的实验结果,采用反向遗传学的技术手段,在日本脑炎病毒感染性克隆E70的基础上,通过融合PCR的方法进行NS2A蛋白的单点突变,成功构建了出T33I、K84A、R98A、R140A、R163A、R171A、K193A、K226A 8个带有点突变的感染性克隆质粒。进行体外转录、转染等实验操作后,在BHK-21细胞系上成功拯救出了T33I、K84A、R98A、R140A、R163A 5种点突变病毒,并通过反转录PCR实验、病毒蚀斑实验、间接免疫荧光实验、确定突变病毒在细胞上具有感染性,并成功引入突变位点,进一步观察到T33I、K84A、R163A突变病毒形成的蚀斑直径明显小于野生型病毒E70。随后,在C6/36、Aag2、293T细胞系上分别接种E70与突变病毒,通过病毒在细胞上的复制能力显示病毒的基本生物学特性。实验结果表明:R98A、R140A、R163A突变病毒在不同细胞系上的生长复制能力与E70基本一致;K84A在3种细胞系上的复制能力都明显减弱,说明K84A位点可能影响了病毒基因组的基本复制与病毒蛋白的包装;T33I位点在信号通路缺陷的C6/36细胞上复制与E70基本一致,而在RNAi通路完整的Aag2与293T细胞中复制能力都明显减弱,说明T33I位点可能影响了病毒VSR的功能。在动物实验中,本研究分别测定了突变病毒在乳鼠、成鼠上的神经毒力与神经侵袭力。结果发现T33I、K84A、R98A位点的突变病毒与E70相比,在神经毒力方面明显减弱,神经侵袭力相对减弱。通过上述研究,我们发现并确认了日本脑炎病毒的NS2A可能是其重要的VSR之一,同时该蛋白的T33I、K84A、R98A对病毒致病性具有重要影响,是关键的毒力(神经毒力或神经侵袭力)位点。上述工作首次在哺乳动物细胞中证实了RNAi调控病毒复制的关键作用,对于深刻理解病毒宿主相互作用具有重要意义。