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B细胞激活因子(BAFF)和诱导增殖配体(APRIL)一样是广泛表达于外周单核细胞,树突细胞,巨噬细胞,中性粒细胞等免疫细胞中的TNF家族成员。APRIL在正常的组织中很少存在,而BAFF在胸腺,胰腺,心脏,肺等器官中仍然低水平的表达。BAFF和APRIL都是典型的Ⅱ型跨膜蛋白,可通过与B细胞表面受体结合,激活细胞内信号通路,引发抗凋亡因子的大量表达和抑制凋亡因子表达来使B细胞数量提升,自身抗体大量表达。所以APRIL和BAFF过量表达会致使免疫自身抗体大量表达,进而引发一系列的自身免疫疾病如系统性红斑狼疮,类风湿关节炎,干燥综合征,重症肌无力,多发性硬化等,及慢性淋巴细胞白血病,滤泡性淋巴瘤,多发性骨髓瘤等B细胞恶性肿瘤疾病。且研究表明BAFF和APRIL表达与一些过敏反应和免疫缺陷疾病有密切关联,如HIV,EB患者体内都检测到高水平BAFF。除同属于TNF家族外,BAFF和APRIL还共用两种受体:钙调节剂和亲环素配体相互作用剂(Trans-membrane Activator and Calcium modulator and cyclophilin ligand Interactor TACI)和 B 细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)。但 BCMA 与TACI对BAFF和APRIL的亲和力不同,TACI对BAFF的亲和力是APRIL的1000倍,BCMA更偏向于结合APRIL。TACI是没有N-末端信号序列的Ⅲ型跨膜蛋白,主要由B细胞和活化的T细胞表达,树突状细胞,单核细胞和T细胞系都可以轻微表达TACI。典型的TNF受体细胞外区域有富含半胱氨酸的结构域(CRD),CRD是由 6 个残基(Phe/Tyr/Trp)Ⅰ-AspⅡ-XⅢ-LeuⅣ-(Val/Thr)Ⅴ-(Arg/Gly)Ⅵ组成的保守序列,由于Ⅱ和Ⅳ具有保守性,因此也称为DxL模序(DⅡ-xⅢ-LⅣ)。该模序用于结合BAFF/APRIL三聚体配体表面的疏水口袋。TACI具有两个CRD,它们具有50%的序列相似性,研究表明,C-末端的CRD在与BAFF/APRIL的结合反应中起主要作用。作为共用受体的BCMA因其主要表达于成熟B细胞表面而命名,骨髓浆细胞,记忆B细胞和生发中心B细胞也表达微量BCMA。BCMA是Ⅰ型跨膜蛋白,氨基酸总数是184,与其它TNF受体相同,BCMA的胞外结构域也具有与三聚体配体表面相结合的CRD结构域。但不同于TACI的是,BCMA的胞外结构域只有一个CRD。BCMA结合BAFF后的信号通路和TACI相似,TACI对BAFF配体的作用通过触发细胞内结构域与TNF受体相关因子(TRAF)相互作用,然后TRAFs释放,磷酸化激活下游IKK,进而磷酸化IκB,释放p50/p65并进入细胞核和靶基因结合依次上调抗凋亡基因如Bcl-2和Bcl-xl的表达。从而起到促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。随着BAFF/APRIL研究的深入,使用拮抗剂阻断BAFF/APRIL与B细胞上受体的结合,进而降低B细胞数量已成为治疗这类B细胞相关疾病的有效策略。目前有三类广泛研究的生物制剂用于治疗BAFF/APRIL引发的疾病。受体融合蛋白,单克隆抗体和拮抗肽。受体融合蛋白是一种嵌合蛋白药物。它通常通过基因工程将人源抗体中的Fc区与天然受体细胞外区域融合而来。融合蛋白可与BAFF/APRIL或可溶性BAFF/APRIL结合,抑制与膜受体的结合以激活细胞内的信号通路,其中研究广泛的有Atacicept和Briobacept。这里的单克隆抗体是指完全人源化的抗体。只是交换人IgG中的可变区来开发具有低免疫排斥性和高稳定性的抗体。目前广泛研究的有Belimumab和Tabalumab。拮抗肽主要是通过噬菌体展示或其它技术获得的高亲和力结合肽。它具有低分子量的优点并且突变范围广,容易找到高于天然受体的高亲和力拮抗剂。治疗BAFF/APRIIL相关自身免疫疾病拮抗肽中,研究著名的有Blisibimod(AMG623)。然而这所有拮抗剂研究中其中除了 Belimumab于2011年经FDA批准上市用于治疗SLE,其余大多面临着治疗效果不能达到预期,过分降低免疫功能,患者感染率上升等问题而被终止。且药物价格昂贵,不能广泛使用也是目前APRIL/BAFF拮抗剂存在的一个问题,因此研究高特异性,稳定性拮抗肽迫切重要。而且虽然BAFF和APRIL的胞外区域有30%的氨基酸序列存在同源性,空间结构和功能结构也有高度的相似性,还共用受体BCMA和TACI,但研究表明BAFF和APRIL之间存在着很大的差异性,在抑制B细胞凋亡中,APRIL可能仅以辅助作用存在,因此BR3作为BAFF的特异性受体,其结构和功能的阐明将为BAFF/APRIL特异拮抗剂的研究和BAFF/APRIL系统的阐明及其重要。BR3是可以只结合于BAFF的特异性受体,它是一种Ⅲ型跨膜蛋白,而且是非典型的TNF受体成员。与BCMA和TACI相比,BR3的细胞外区域最小,其CRD区域只是TACI和BCMA的一部分。且研究表明BR3结合BAFF后的信号通路不同于TACI/BCMA,结合BAFF后的BR3,可以降解TRAF而释放NIK,然后磷酸化IKKα,继而激活p100,导致p100发生磷酸化依赖性切割以产生活性p52-Rel B复合物。此外,BAFF还通过c-myb抑制PKCδ的核移位,从而保护B细胞免于凋亡。因此对于BR3的研究对BAFF自身信号传导的进一步阐明,BAFF系统相关疾病的研究具有重要意义。本研究中,BR3作为BAFF的特异性受体,我们通过晶体结构重叠,发现BR3的特异性结合是由于BR3半胱氨酸富集区CRD外的序列与APRIL的空间位阻效应造成的。BR3的K44氨基酸残基与APRIL的A120D121氨基酸残基之间存在的位阻效应,阻碍其相互结合。由于实验室条件下构建表达的人源化APRIL蛋白包涵体严重,纯化困难,实验条件无法制备,且研究表明鼠源化APRIL(murine APRIL,mAPRIL)和人源化APRIL之间存在85%的同源性,在APRIL的疏水结合功能区,氨基酸更是高度保守,很多研究中可以使用鼠源APRIL替代人源化APRIL,因此我们使用mAPRIL蛋白代替人源APRIL来分析受体与其活性结合。ELISA结合实验结果中,在40 μg/mL的浓度下BR3-Fc结合BAFF达到饱和,mAPRIL与BR3结合与Fc对BAFF和APRIL的相同。这表明BR3是BAFF的高亲和力和特异性受体,与之前的研究报道相符,且我们纯化保存的mAPRIL在亲和性能鉴定上可以替代human APRIL。为了证实DxL结构域之外的序列在BAFF特异性结合过程中的其他作用,我们将BR3胞外结合区分为两段,BR3-1和BR3-2。BR3-1是由BR3蛋白胞外区的C24-C35序列组成,BR3中存在4个半胱氨酸(C19,C24,C32,C35),以形成两个二硫键区域(C19-C32,C24-C35),我们选取包含DxL模序的(C24-C35)区域作为BR3-1序列区域,C35序列后包含3个脯氨酸(P41,P43,P45)的序列作为BR3-2。通过引物重叠,基因融合,亲和色谱层析柱等技术构建表达出了相应的Fc融合蛋白。通过融合蛋白和BAFF/APRIL的亲和性能分析,我们发现BR3-2-Fc不仅可以结合于BAFF还可以结合APRIL,所以BR3-2区域不是BAFF的信号肽起到特异性识别的功能,BR3的特异性结合性能主要是由于空间位阻效应的作用。融合蛋白对BAFF的亲和能力中BR3-1-Fc+BR3-2-Fc<
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