2018年我国恶性肿瘤报告数据显示:无论是从泌尿系肿瘤的发病率或致死率来看,膀胱癌均排名首位。伴随我国经济的快速发展,工业高度发达势必将导致环境污染,而医疗环境和技术的改善使得人均寿命也不断延长,这两者结合导致膀胱癌发病率逐年增加,而且越发呈低龄化趋势,膀胱癌的诊断与治疗逐渐成为公共卫生领域亟待解决的问题。2014版膀胱癌诊断治疗指南中指出,目前手术仍然是最主要的治疗方法,而一些免疫疗法和新辅助放化疗在膀胱癌治疗也取得了一定的疗效。但值得注意的是,大约15%的膀胱癌患者确诊时已发生远端器官转移,根治性膀胱切除术后仍有约高达40%浸润性膀胱癌患者出现远端复发转移,仍然有30%的表浅性膀胱癌会转化为转移性癌或浸润性癌,这导致膀胱癌患者远期疗效差、预后不佳;恶性肿瘤患者治疗失败术后复发甚至死亡很重要的一部分原因就是转移与侵袭。因此,明确膀胱癌侵袭转移的分子机制迫在眉睫,这也可能会为寻找基因治疗靶点、对患者预后进行评价奠定基础。在人体生物轴信号传导通路中,很多重要通路都由趋化因子与对应的受体共同构建的,这些信号通路与肿瘤生物学行为密切相关。CXCL12,也称为基质细胞衍生因子-1。在结直肠癌、胃癌等肿瘤的浸润、转移过程、以及产生耐药性的过程中,CXCL12与其专一性受体CXCR4发挥了一定的作用。但值得注意的是,在表达水平上,CXCL12和CXCR4之间还存在一定程度的差异。随着研究的深入,人们逐渐发现了与CXCR4序列高度相似的另一特异性受体CXCR7。数据表明,在宫颈恶性肿瘤、肾恶性肿瘤等组织中,CXCR7表达水平高于正常组织,但现在仅有少量的数据能够分析膀胱癌中CXCR7蛋白的表达水平。本文主要进行CXCR7在人膀胱尿路上皮细胞癌中的生物学作用及分子机制研究:1、为了探讨在膀胱尿路上皮细胞癌增殖与分化、增殖与转移中CXCR7是否发挥关键作用本研究利用蛋白质印迹法和免疫组织化学染色法分析了 CXCR7蛋白在膀胱尿路上皮癌中和正常膀胱粘膜组织中的表达水平;2、筛选CXCR7表达水平较高的细胞系,使用慢病毒CXCR7-shRNA进行CXCR7表达的干扰分析干扰后膀胱尿路上皮细胞系的增殖情况、侵袭能力进行验证膀胱癌细胞生物学行为是否受到CXCR7的调控,为膀胱癌形成的分子机制和后续治疗的研究奠定基础。本课题研究内容分为以下两大部分:第一部分趋化因子受体7在人膀胱尿路上皮细胞癌组织中的表达情况分析研究目的:探讨CXCR7在膀胱尿路上皮癌中和正常膀胱粘膜组织的表达情况,利用蛋白质印迹法和免疫组织化学染色法分析CXCR7蛋白在两者中的表达水平,旨在探讨在膀胱尿路上皮细胞癌增殖与转移中CXCR7是否发挥关键作用;CXCR7是否能成为膀胱尿路上皮细胞癌患者预后判断的有效指标和靶向治疗的新靶点。研究内容:11免疫组化方法检测2016年5月至2018年5月在锦州医科大学附属第-一医院泌尿外科通过手术切除并经病理证实的97例膀胱尿路上皮细胞癌组织样本及与之对应的正常膀胱粘膜组织中的CXCR7表达,半定量分析其表达水平;2 Western blot测定组织样本中的CXCR7蛋白表达阳性率;3 根据CXCR7在膀胱尿路上皮细胞癌中表达的染色强度与阳性细胞数对膀胱尿路上皮细胞癌和正常粘膜组织中CXCR7蛋白的表达水平及与病理分级、临床分期之间的关系进行分析。研究结果:1 CXCR7在膀胱尿路上皮细胞癌的细胞质和/或细胞膜分别强染色。正常膀胱粘膜组织中无染色,两组组织染色强度的差异有统计学意义(P<0.05);2 CXCR7蛋白在正常膀胱粘膜组织仅有3例弱表达(3/97);与正常组织相比,膀胱尿路上皮细胞癌组织中CXCR7阳性表达率较高,两者统计学分析χ2=45.263,p<0.01,差异有统计学意义;3 CXCR7蛋白在高级别组中呈高表达、低表达或未表达的分别为34例、1例,占97.14%和2.86%。CXCR7蛋白低级别中呈高表达、低表达或未表达的分别为47例、15例,占75.81%和24.19%,差异有统计学意义(χ2=7.126,r=0.694,p<0.05),表明CXCR7蛋白的表达与膀胱尿路上皮细胞癌病理分级情况呈正相关关系;4 CXCR7蛋白在非浸润组呈高表达、低表达或未表达的分别为21例、30例,占41.18%和58.82%。CXCR7蛋白在浸润性组呈高表达、低表达或未表达的分别为41例、5例,占为89.13%和10.87%,差异有统计学意义(χ2=17.596,r=0.715,p<0.05),表明CXCR7蛋白的表达与膀胱尿路上皮癌临床分期情况呈正相关关系;5 对膀胱尿路上皮癌中CXCR7蛋白的表达与其他临床指标进行相关性分析,发现膀胱尿路上皮癌患者的性别(p=0.516)、年龄(p=0.307)、肿瘤大小(p=0.884)以及是否吸烟(p=0.917)等方面与CXCR7蛋白的表达水平无相关性;6 Western blot结果显示,在正常粘膜组织中,CXCR7蛋白表达平均相对灰度值为0.315±0.104,在膀胱尿路上皮细胞癌中,CXCR7蛋白表达平均相对灰度值为0.964±0.276,两组间CXCR7蛋白表达差异存在统计学意义(t=6.552,p<0.05);7 非浸润性组CXCR7蛋白相对灰度值均数为0.851±0.319,浸润性组相对灰度值均数为1.148±0.254,通过单因素方差分析得出F值为4.008,两组CXCR7相对灰度值均数存在统计学差异(p<0.05);8、CXCR7蛋白在高级别组中相对灰度均值为1.253±0.406,CXCR7蛋白在低级别组中相对灰度均值为0.941±0.305,单因素方差分析结果显示,CXCR7蛋白在高级别组和低级别组之间的差异存在统计学意义(F=3.947,p<0.05),说明在膀胱尿路上皮细胞癌中,病理分级随CXCR7蛋白表达水平的提高而升高。研究结论:1膀胱尿路上皮细胞癌与正常组织中的CXCR7蛋白的表达量比较,前者显著高于后者,说明CXCR7蛋白可能为促进膀胱癌发生发展的重要因子。2 CXCR7蛋白的表达膀胱癌病理分级和临床分期呈正相关关系,CXCR7可能成为重要辅助判断指标。3 对膀胱癌进行靶向治疗时,CXCR7可能成为新靶点,具有一定的临床意义。第二部分慢病毒介导的RNAi沉默CXCR7后对人膀胱尿路上皮细胞癌细胞生物学行为的影响研究目的:逆转录-聚合酶链反应分析了 CXCR7 mRNA在不同尿路上皮癌细胞系的表达,筛选CXCR7表达水平较高的细胞系,筛选出CXCR7沉默效率较高的慢病毒CXCR7-shRNA载体,将其转染入CXCR7表达水平较高的细胞系后,对CXCR7蛋白和mRNA的表达情况进行分析,以此来验证转染后的干扰效果;对膀胱尿路上皮细胞系增殖情况、侵袭能力进行分析,验证膀胱癌细胞生物学行为是否受到CXCR7的调控,为膀胱癌形成的分子机制和后续治疗的研究奠定基础。研究内容:11培养并观察人膀胱尿路上皮细胞癌细胞株BIU-87、5637、J82和EJ-1的生长情况;逆转录-聚合酶链反应定量分析了 CXCR7 mRNA在BIU-87、5637、J82和EJ-1的表达,选择表达量较高的BIU-87细胞作为实验目的细胞;2 终点稀释实验测定病毒滴度的同时,荧光倒置显微镜对构建包装的3组慢病毒载体CXCR7-shRNA和阴性对照组进行观察;3 对3组慢病毒载体CXCR7-shRNA和阴性对照组的最佳感染指数进行测定,筛选具有最佳感染指数的慢病毒载体CXCR7-shRNA;4 将筛选后的CXCR7-shRNA转染膀胱尿路上皮细胞癌细胞BIU-87中,测定不同慢病毒载体的沉默效率,筛选沉默效率最高的慢病毒载体CXCR7-shRNA;5 BIU-87细胞的增殖利用四唑盐(MTT)比色法进行分析;6 BIU-87细胞迁移数量利用Transwell侵袭实验计算,分析CXCR7基因沉默后BIU-87细胞侵袭的抑制程度;7 细胞划痕实验检测沉默CXCR7后对膀胱尿路上皮细胞癌细胞BIU-87迁移速度的影响。研究结果:11在膀胱尿路上皮细胞癌细胞BIU-87和J82细胞株中,CXCR7 mRNA呈高表达趋势,以BIU-87为较高表达;而在5637和EJ-1细胞株中表达水平较低,因此我们选取BIU-87细胞为后续实验细胞系;2 测序验证所构建的载体CXCR7-shRNA插入位置正确,DNA重组成功,且无碱基突变。转染CXCR7-shRNA慢病毒载体至BIU-87后,发现细胞肿胀变圆或触角回收、细胞脱落悬浮于视野中的典型CPE现象,与此同时也伴有大量绿色荧光表达。三组慢病毒载体及阴性对照的滴度分别为:阴性对照:8.29X 108 pTU/ml、CXCR7-shRNA-3:5.17 X 108 pTU/ml;CXCR7-shRNA-2:5.04 X 108 pTU/ml;CXCR7-shRNA-1:6.57 X 108 pTU/ml,病毒滴度均在正常范围内,可以进行后续的转染实验;3 在1、2、3三组中CXCR7 mRNA表达水平明显降低,与对照组(4组)相比差异具有统计学意义(p<0.05);转染组(1组)能显著抑制BIU-87膀胱尿路上皮癌细胞系中CXCR7 mRNA的表达水平,与转染组2组、3组比较差异有统计学意义(p<0.05),因此,经过筛选后,我们选取慢病毒滴度最高的CXCR7-shRNA-1(6.57×108 pTU/ml)载体作为后续实验转染的病毒载体;4 对实验组(A组)和未转染病毒组(B组)的细胞进行常规培养,在0、24、48、72、96、120h测定光吸收值,利用生长曲线分析两组BIU-87细胞增殖情况。B组细胞以几何倍数增长,A组细胞增殖速度显著下降,两组比较具有统计学意义(p<0.05),说明慢病毒CXCR7-shRNA-1可以良好的沉默BIU-87细胞中CXCR7基因表达,减缓BIU-87细胞的增殖速度;5 转染慢病毒载体CXCR7-shRNA-1 48h后,A组和B组细胞穿膜数量为103.874±11.253和292.157±19.069,两组比较具有统计学意义(p<0.05),实验组可以抑制64.45%细胞的穿膜过程,沉默BIU-87中的CXCR7基因表达后,细胞向远处的侵袭能力受抑制;6 BIU-87细胞在划痕24h后,对照组和实验处理组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.27±9.58)%和(26.14±7.26)%,有统计学意义(p<0.05);划痕48h后,对照组与实验处理组的MI分别为(91.05±17.22)%和(59.36±11.29)%,有统计学意义(p<0.05)。提示,CXCR7-shRNA-1可以使BIU-87细胞的迁移指数降低,进一步降低膀胱尿路上皮细胞癌细胞的迁移能力。研究结论:11本文检测了尿路上皮癌BIU-87、5637、J82和EJ-1细胞中CXCR7 mRNA的表达水平,发现在膀胱尿路上皮细胞癌细胞BIU-87和J82细胞株中,CXCR7 mRNA呈高表达趋势;而在5637和EJ-1细胞株中表达水平较低,其中,CXCR7 mRNA在BIU-87细胞中表达水平较高,将其用于后续实验。2 CXCR7-shRNA重组慢病毒载体构建成功,其可以对CXCR7基因进行有效沉默,发现重组慢病毒CXCR7-shRNA-1的沉默效率最高,将其用于后续实验。3 利用CXCR7-shRNA-1对CXCR7基因进行沉默,可以对膀胱尿路上皮细胞癌细胞BIU-87的表达及增殖能力产生显著的抑制作用。4 重组慢病毒载体CXCR7-shRNA能够显著抑制尿路上皮细胞癌细胞BIU-87的局部侵袭及远处转移的能力。