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下丘脑作为控制摄食的初级整合系统,对摄食起关键作用,下丘脑腹内侧核(Ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)作为摄食控制环路中的一个重要核团,因其显著的抑食作用被称为饱中枢。近代关于摄食生理的研究结果表明,各种与摄食有关的信息经相应的神经通路和有关的神经递质作用于下丘脑外侧区,激发摄食行为;进食后,内分泌、体液等因素的相应改变,再沿相应通路作用于VMH,终止摄食行为。在这一过程中,葡萄糖反应神经元对于摄食起着重要的作用,而胃肠道迷走神经则是外周摄食信息传递入脑的通路之一,胃迷走神经传入纤维可将摄食负反馈信号传入VMN,VMH再通过胃迷走神经传出纤维抑制胃肠运动,最后终止摄食行为。芍药属毛茛科植物,味苦酸,微寒,有养血柔肝、缓急止痛作用,是一味养阴柔肝的常用中药,但不少文献报道其对消化道运动具有显著性作用,且有神经中枢抑制作用。《本草纲目》也记载:白芍药益脾,能于土中泻木。可见对消化有一定的调节作用,但综观目前国内外芍药或芍药苷对消化调节尤其是摄食方面的研究,大多限于复方或整体效应的观察,普遍重视胃肠道功能状态本身对食欲的影响,忽视了中枢神经系统对摄食行为的调控作用。文献报道芍药及芍药苷(paeoniflorin,PF)具有调节机体免疫功能,抑制副交感神经兴奋,降低平滑肌张力和调节消化道运动等作用,但以往研究PF对中枢神经系统摄食中枢影响报道并不多见。我们在对以白芍为主药的成药(复方儿宝颗粒和宝宝乐口服液)的研究表明,儿宝颗粒不仅能在外周水平上调节与摄食相关的多种因素,如促进胃肠道蠕动、增强消化酶的活性、促进小肠吸收功能、调节胃肠道激素水平等,还能在中枢水平上影响摄食行为的控制。为进一步探讨PF的作用机制,本实验主要以幼龄大鼠下丘脑VMH神经元为研究对象,采用红外可视脑片膜片钳技术,记录VMH不同类型神经元的被动特性、放电频率等电生理指标及PF对不同类型神经元电生理指标的影响。本实验重点在于研究运脾复方的主要有效成分PF对下丘脑摄食中枢腹内侧核神经元电活动的影响,以探讨并分析复方中的单味中药芍药及PF对神经中枢摄食调节机制方面的作用。一、本研究的主要内容:实验一:应用红外可视脑片膜片钳技术研究下丘脑腹内侧核神经元的电生理特性目的应用红外可视脑片膜片钳技术,初步观察大鼠下丘脑腹内侧核(VMH)神经元的电生理特性。方法应用红外可视脑片全细胞膜片钳技术,观察和分析健康幼龄SD大鼠下丘脑VMH神经元形态结构和基本电生理特性。结果红外可视膜片钳技术可清楚的观察到脑细胞形态结构,并根据大鼠VMH神经元树突数目的多少和不同的放电模式将其分为三种类型:Ⅰ型神经元在静息电位没有自发放电,但有相对较小的膜时间常数和输入电阻,分别为(7.5±2.3)msec和(193.0±31.0) M?(n=15);Ⅱ型神经元静息电位具有规律性自发放电,膜时间常数(14.1±2.2)msec和输入电阻(338.8±42.6)M?(n=45),较Ⅰ型神经元显著增大( P<0.05);Ⅲ型神经元静息电位有自发放电,但为簇状放电,膜时间常数(23.8±2.5)msec和输入电阻(511.8±70.5) M?(n=21),较Ⅰ型和Ⅱ型神经元都显著增大( P<0.05)。实验二:芍药苷对离体幼龄大鼠下丘脑VMH神经元电活动的影响目的研究PF对正常大鼠下丘脑VMH神经元兴奋性的影响。方法应用脑片全细胞膜片钳技术记录了35个正常的VMH神经元的自发放电,观察PF对它们的作用。结果①PF(300μmol/L)使62.8%的VMH神经元放电频率明显减少(n=22),其平均放电频率从(7.1±2.2)Hz减少到(3.2±0.7)Hz(P <0.01),在去极化方波刺激下放电数目也明显减少,洗脱后恢复;放电频率的改变且呈剂量依赖性;22.9%的神经元无明显反应(n=8);14.3%的神经元放电频率明显增加(n=5),其平均放电频率明显增加(n=5),其平均放电频率由(4.7±0.8)Hz增加到(5.2±0.4)Hz。实验三:芍药苷对大鼠下丘脑葡萄糖反应性神经元的作用目的通过观察PF对大鼠下丘脑中葡萄糖反应性神经元电活动的影响,探讨单味中药芍药对摄食活动调控的机制。方法应用脑片全细胞膜片钳技术记录大鼠LHA及VMH的神经元电活动,灌流槽内加入Glucose(100μmol/L)鉴别葡萄糖敏感性神经元(glucose-sensitive neurons,GSNs)及葡萄糖受体神经元(glucoreceptor neurons,GRNs),灌流PF,观察其对葡萄糖反应神经元及非葡萄糖反应神经元自发放电频率的影响;同时灌流PF和glucose的混合液,观察上述效应是否可重复出现。结果在LHA,PF对GSNs有明显的兴奋作用,与其对该核团NGSNs的作用相比较,差别有统计学意义( P < 0.05);在VMH,PF对GRNs有明显的抑制作用,与其对该核团NGRNs的作用相比较,差别有统计学意义( P < 0.01)。对PF有反应的神经元在给予PF和glucose的混合液后,神经元的放电频率无明显变化。二、主要研究结论:1. VMH具有三种不同电生理特性的神经元,根据大鼠VMH神经元树突数目的多少和不同的放电模式,揭示了VMH神经元具有多样性的特征。2. PF对VMH神经元兴奋性的调节具有选择性。3. PF不仅能够提高下丘脑LHA神经元的兴奋性,增强LHA的活动,并且降低大部分VMH神经元的兴奋性,使饱中枢的活动水平下降。4. PF主要兴奋LHA-GSNs同时抑制VMH-GRNs,这一途径可能是PF促进摄食活动的神经调节机制之一。