玻璃化法超低温保存是目前最实用有效的植物种质离体保存技术之一,它具有节省空间、无需继代、避免污染、设备简单、操作简便等优点。本实验在前期建立的罗汉果玻璃化法超低温保存技术体系的基础上,对影响小滴玻璃化法超低温保存的主要因素进行单因素和正交实验,探索其适宜的超低温保存程序。用AFLP和MSAP技术检测和分析继代材料和保存后材料基因组DNA结构和甲基化变化,评价其遗传稳定性。小滴玻璃化法超低温保存技术体系的建立可为罗汉果超低温保存提供形态和分子基础,为罗汉果种质资源的保护和开发利用提供依据。主要实验结果如下:1.对超低温保存预培养天数进行比较,结果表明,青冠茎尖预培养1d效果最好,最高存活率能达到67%,再生率达到21%。2.对超低温保存预培养基蔗糖浓度进行比较,结果表明,含0.7mol/L蔗糖的MS液体培养基效果最好,青冠茎尖的存活率和再生率最高,分别为68%和21%。3.用60%PVS2装载青冠茎尖不同时间对实验结果影响显著,装载30min效果最好,存活率达到66%,再生率为27%。4.不同脱水时间对超低温保存效果影响明显,青冠茎尖脱水10Omin时获得67%的存活率和31%的再生率,为最佳效果。5.对影响超低温保存的三个重要因素预培养、装载、脱水进行正交实验,筛选出青冠茎尖的最佳实验组合条件:含0.7mol/L蔗糖的预培养基+30min装载时间+90min脱水时间,存活率和再生率分别为76%和62%。将其应用于绿兴、科技1号和正东三个品种,超低温保存后的存活率和再生率分别为62%和34%、53%和19%、41%和14%,品种间差异明显。6.对4个继代品种和3个冻存品种的DNA进行AFLP分析,结果表明,4个继代品种都出现了差异条带,平均差异位点率为4.94%,超低温保存前后的差异较继代略高,平均差异位点率达到6.65%,说明继代和冻存改变了罗汉果DNA的结构。不同品种在继代和冻存中变异程度不同。7.运用MSAP技术对4个继代品种和3个冻存品种的甲基化状态进行分析,结果表明,继代和冻存使罗汉果基因组DNA总甲基化比率降低,冻存的甲基化程度低于继代的,品种间青冠的总甲基化比率最小。继代和冻存产生了三种类型的甲基化变异,变异的主要趋势是去甲基化,变异率冻存的高于继代的,变异率科技1号最高,达7.60%,青冠的最小,4.81%。