第一部分培养时间对下丘脑神经元细胞内钙信号的影响目的:衰老会引起细胞内静息钙离子浓度的升高,更能够引起细胞对各种损伤因素所导致的钙超载的处理能力下降。而在衰老的神经-内分泌学说中,认为下丘脑是衰老的起步点。长时间培养的细胞在一定程度上能够反映在体细胞的衰老、退化过程。因此,本实验选用原代培养不同时间的下丘脑神经元作为研究对象,采用高浓度的KCl处理神经元造成细胞内钙超载,观察培养时间对下丘脑神经元细胞内钙信号的影响。方法:采用荧光钙离子成像和膜片钳技术,对四个培养时间段的下丘脑神经元分别进行以下研究:(1)细胞内钙离子水平记录,采用25 mM KCl处理下丘脑神经元,探讨培养时间对细胞处理钙超载能力的影响,观察钙离子浓度升高的幅度与恢复到基础水平的过程。(2)采用全细胞膜片钳记录,观察培养时间对电压依赖性钙通道功能的影响。结果:(1)对于不同培养时间的下丘脑神经元,分别给予25 mM KCl所引起的细胞内静息钙离子浓度升高的幅度相似,但随后的恢复过程存在很大差异。随培养时间的延长,钙离子恢复的速度和幅度均明显降低。(2)膜片钳实验中,随着培养时间的延长,电压依赖性钙通道所介导的电流的幅值,膜电容的大小均升高,给予nifedipine后发现,其中L-型钙通道所占的比率随着培养时间的延长明显增加。结论:下丘脑神经元内,钙稳态调节机制的损害与培养时间存在相关性,与培养早期的神经元相比,培养中晚期的神经元排出细胞内过多的钙离子所需的时间更长。而胞膜L-型钙通道电流的增加参与了钙稳态调节机制的异常。第二部分瘦素对不同培养时间的下丘脑神经元细胞内钙信号的调节目的:瘦素是肥胖基因编码,脂肪细胞分泌的蛋白质,主要作用于下丘脑调节摄食和能量代谢。钙离子是细胞内常见的第二信使,是参与下丘脑神经内分泌调节的主要离子。本实验中,我们主要研究瘦素对下丘脑神经元细胞内钙信号的调节作用及该调节作用与培养时间的关系,以观察瘦素在“能量代谢异常-神经内分泌紊乱”联动机制中的作用及其与衰老的关系。方法:对四个培养时间段的下丘脑神经元分别进行以下实验:(1)采用荧光钙离子成像技术,研究瘦素对细胞内静息钙离子浓度的影响,及其对25 mM KCl引起的细胞内钙升高的调节作用。(2)采用全细胞膜片钳技术,研究瘦素对不同培养时间的下丘脑神经元电压依赖性钙通道的作用。(3)采用免疫荧光和Western Blot技术,检测各个培养时间段下丘脑神经元上瘦素受体的表达情况。结果:(1)瘦素对四个培养时间段的下丘脑神经元细胞内静息钙离子浓度没有影响,但能够抑制KCl所引起的钙离子浓度升高的幅度,抑制作用在体外培养的16天达到峰值,到培养晚期,抑制作用减弱。(2)瘦素对电压依赖性钙通道的作用,出现电流增加和减少两种反应,统计每一培养时间段的两种反应的比例后发现,调节作用在培养的中期最强,培养晚期减弱。(3)在体外培养的第3天,9天,16天,随培养时间延长,瘦素受体的表达增强,到培养的第23天,瘦素受体的表达显著降低。结论:瘦素能够抑制KCl所诱发的下丘脑神经元细胞内钙离子的升高,电压依赖性钙通道在其中起了重要作用,抑制作用与培养时间相关,而瘦素受体的表达变化可能在这种相关性中扮演了重要角色。第三部分瘦素通过不同的信号通路介导对NPY和POMC神经元电压依赖性钙电流的作用目的:NPY和POMC神经元是下丘脑内调节摄食和能量代谢的主要效应细胞,大量研究已证实,瘦素能够抑制NPY神经元的活性而增加POMC神经元的活性。电压依赖性钙通道在调节神经细胞兴奋性上发挥了重要作用。在本实验中,我们分别研究瘦素对于NPY和POMC神经元电压依赖性钙通道的作用,探讨瘦素调控这两类神经元兴奋性的电生理机制。方法:(1)采用免疫组化方法鉴定与摄食相关的NPY和POMC神经元;(2)结合形态学特征,采用全细胞膜片钳技术及及记录后的再次鉴定比对,研究瘦素对这两类神经元电压依赖性钙通道的调节作用及其信号通路。结果:(1)NPY和POMC神经元在形态上存在明显差异,典型的NPY神经元细胞体较小,成三角形或纺锤形,大部分具有1-3个细小的,不分枝的一级树突。POMC神经元细胞体较大,成四边形或多极核周体,一级树突数量不定,且分支较多。(2)瘦素通过LEPR-JAK2-MAPK信号通路抑制NPY神经元的钙电流,通过LEPR-JAK2-PI3-k信号通路增强POMC神经元的钙电流,其中主要是L-型钙通道介导了瘦素的调节作用。结论:瘦素通过不同的信号通路调节NPY和POMC神经元电压依赖性钙通道,对神经元活性产生不同的影响。