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噬病毒体(Virophage)是一类小型双链DNA病毒。此类病毒的成熟病毒粒子没有囊膜包裹,仅由直径为35-74nm的二十面体核衣壳和编码16-34个基因的长度为17-19kb的基因组组成。该病毒不能在真核细胞宿主内独立增殖,必须依赖其宿主病毒的病毒工厂增殖,并在增殖过程中造成宿主病毒的形态畸形和毒力下降,甚至可以将成熟病毒粒子包装到宿主病毒的核衣壳内,如同侵染宿主病毒。类比噬菌体的概念,遂将此类病毒统称为噬病毒体。而在由真核细胞(Cell)、宿主病毒(Virus)、噬病毒体(Virophage)组成的侵染系统(我们称之为CVV系统)中,噬病毒体与其宿主病毒在侵染策略、增殖方式、基因结构、进化关系、免疫机制等方面所表现出的奇特性质对于我们理解病毒的本质具有重大意义。虽然已有证据表明噬病毒体可能是一大类普遍存在的新型病毒,但迄今为止仅得到18个噬病毒体全基因组和3个可培养的CVV系统。而这3个CVV系统都是建立在两种模式细胞(阿米巴变形虫和海洋鞭毛虫Cafeteria roenbergensis)内。有没有其他细胞可以形成新的CVV体系呢?近年来关于新型噬病毒体的研究给出了绿藻-藻类巨病毒-噬病毒体构成的新型CVV体系的潜在可能。本文就是在前人的基础上进一步探索以藻类为模式细胞的新型CVV体系。通过深度挖掘滴水湖宏基因组数据库,调整分析思路,革新分析方法,重点探索新型噬病毒体和藻类巨病毒基因组,并深入研究新型噬病毒体与其潜在巨病毒的互作关系。与此同时,尝试在蛋白水平揭示新型噬病毒体与其真核宿主的关系。在此基础上,初步尝试建立以滴水湖原位分离的单细胞藻类、藻类巨病毒、噬病毒体为代表的新型CVV系统。具体结果如下:(1)获得4株新型噬病毒体的全基因组序列。通过在序列拼接方面大量的摸索后,我们最终从滴水湖宏基因组数据库中得到四条新型噬病毒体全基因组序列。它们分别被命名为Dishui Lake Virophage 3/4/5/6(简称DSLV3/4/5/6),其序列长度分别为31,512bp、30,873bp、26,593bp、28,714bp,除DSLV3外,其余都是环形基因组。此外,在DSLV3基因组末端非对称位置发现了回文重复,这种现象在巨病毒基因组中也有发现,这或许预示着噬病毒体DSLV3具有独特的基因组结构。系统发育分析发现,这些新型噬病毒体可以与黄石公园湖噬病毒体(YSLVs)以及南极有机湖噬病毒体(OLV)归于同一分支,而独立于已知的3个CVV系统中的噬病毒体(Sputnik、Mavirus、Zamilon)分支之外。比较基因组研究发现,在DSLVs中存在藻类巨病毒、藻类RNA病毒、单细胞真核藻类的同源基因,这些基因的发现预示着这类新型噬病毒体与宿主系统间的水平基因转移,同时在基因组层面揭示了滴水湖噬病毒体与其宿主的相互作用。(2)获得4株新型巨病毒的全基因组序列。在发现噬病毒体基因组上有藻类巨病毒基因后,我们又对滴水湖数据库进行了藻类巨病毒基因组的针对性分析。经过大量的序列拼接工作,我们最终得到4株新型藻类巨病毒全基因组序列。它们分别是Dishui Lake Phycodnavirus 2/3/4/5(简称DSLPV2/3/4/5)。它们的序列长度分别为190,426bp、194,169bp、392,531bp、193,666bp。它们的基因组结构,除DSLPV4属于环状外,其余都是线性。系统发育分析发现这些来源于淡水环境中的藻类巨病毒与海洋藻类巨病毒Prasinovirus具有近亲关系,这一发现也拓展了我们对藻类巨病毒分布多样性的认识。值得一提的是,在新发现的这些藻类巨病毒基因组中不仅存在上述滴水湖噬病毒体同源基因,还存在单细胞绿藻Prasinophytes纲中相关藻类的基因。这与在滴水湖噬病毒体基因组中的发现相互印证,进一步说明了滴水湖生态系统中存在以噬病毒体、藻类巨病毒、真核藻类构成的新型CVV系统的可能性。(3)获得滴水湖噬病毒体DSLV3衣壳蛋白(MCP)多克隆抗体。通过构建p GEX-4T1-MCP表达系统,我们成功在原核表达系统中首次表达噬病毒体衣壳蛋白,但随后的实验表明,该蛋白属于包涵体蛋白而不是我们需要的上清蛋白。紧接着我们尝试对该表达系统进行了各种优化,以期能得到该蛋白的上清表达,但都没有成功。为了不影响后续试验进展,最终我们放弃该蛋白的表达,而将该蛋白的表达和抗体制备工作交由上海生物公司,最终我们得到了该蛋白的抗体,为后续实验的开展提供支持。(4)获得一株真核绿藻Mychonastes afer。通过前期的滴水湖数据库中各物种多样性分析的工作,我们已经对滴水湖中藻类的物种信息情况有了大致的了解,再结合上述基因组分析结果,我们初步判定在滴水湖生态系统中存在以绿藻(尤其是Prasinophytes纲)、藻类巨病毒(DSLPVs)、噬病毒体(DSLVs)为代表的新型CVV系统。为了验证该假定,我们尝试在滴水湖进行单细胞绿藻的原位分离。通过划线和涂布分离,我们幸运的得到一株单细胞绿藻(藻类分离纯化工作还在进行中)。分子鉴定并结合形态学分析确认它们分别是Mychonastes afer。在分类地位上,这株绿藻与Prasinophytes纲的绿藻是近亲。随后我们将开展构建CVV侵染体系的工作。在整个实验过程中,我们摸索出了一套完整的藻类分离和纯化实验流程,这对于后续试验具有指导意义。