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目的：构建针对II型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type2, HSV-2) ICP4基因的短发夹RNA (small hairpin RNA, shRNA)重组表达载体,在细胞水平上观察载体表达的shRNA对ICP4基因表达的抑制作用,以及对病毒复制的影响。方法：针对HSV-2ICP4基因,设计、筛选得到1条拟干扰靶位点,构建1组针对ICP4基因的短发夹RNA的真核表达载体,以及不针对该基因的阴性表达载体shRNA NC。采用脂质体转染法介导重组表达载体转染人胚胎肾293株细胞(Human Embryonic Kidney cells, HEK293),流式细胞仪检测其转染效率,接种HSV-2。采用实时荧光定量RT-PCR技术检测mRNA转录情况,Western blot检测蛋白表达情况,终点滴定法检测细胞上清液中的各组病毒滴度。结果：(1)酶切鉴定重组质粒表达载体构建成功。(2)重组载体转染效率48h后达到最高值,转染效率可达80%。(3)实时荧光定量RT-PCR结果显示,与空白组比较,ICP4shRNA组可明显降低ICP4mRNA的表达水平(P<0.05),抑制率可达71.28%。(4) Western blot结果显示,与空白组比较,ICP4shRNA组可明显降低ICP4蛋白的表达水平(P<0.05)。(5)终点滴定法检测病毒活力,结果显示,ICP4shRNA组可明显降低子代病毒的活力(P<0.05)。结论：成功构建pGPU6/Neo-shRNA重组质粒表达载体,重组载体转入细胞后能抑制HSV-2ICP4基因的表达,并且降低病毒的活力,为进一步实现RNAi技术在抗HSV-2研究中的应用提供理论依据。