研究背景以蛋白质为主体的生物大分子,维系着健康机体所需的几乎所有的生命活动。全面了解这些蛋白质及其复合物、组装体的三维结构、相互作用及运动方式,以及它们与正常生物学功能和异常病理现象关系的结构基因组学具有战略性的关键地位。细胞代谢的改变是肿瘤的一个重要特征。本论文研究对象为两种在代谢中起关键作用的蛋白,D-2-羟基戊二酸脱氢酶和内质网蛋白Reticulocalbin-l,根据文献报道及本实验室前期研究结果,两种蛋白均通过代谢影响肿瘤的发生。D-2-羟基戊二酸(D-2-HG)是机体产生的低浓度代谢物,其主要来源于三羧酸循环中重要代谢中间物α-酮戊二酸(α-KG)。近来,大量研究表明D-2-HG是一种促癌代谢物,在脑胶质瘤、急性髓性白血病以及其它多种癌症中均发现D-2-HG的异常积累,从而可能通过竞争性地抑制α-KG依赖型酶,导致癌症发生。目前,对D-2-HG代谢通路的相关研究获得了肿瘤研究领域诸多关注。D2HGDH作为D-2-HG的主要分解代谢酶,不仅严格地维持着D-2-HG的低浓度,还参与α-KG的调节,在机体代谢过程中扮演重要角色。然而,目前对D2HGDH发挥功能的分子机制至今仍知之甚少,由此开展了本部分研究。内质网是细胞重要的细胞器,直接参与并影响细胞的各种生命活动。内质网腔中的伴侣和酶对于确保正常的内质网功能至关重要。因此,多项研究试图揭示内质网驻留蛋白的作用和调控机制。Reticulocalbin-1(RCN1)是定位于内质网腔内的钙结合蛋白,属于CREC家族。近期研究揭示RCN1表达异常与疾病,特别是肿瘤的发生密切相关。RCN1在高侵袭性的乳腺癌细胞、结直肠癌细胞等癌症中呈高表达,而在前列腺癌细胞中呈低表达。然而RCN1的确切功能依然未知,其作用机制更加不明确,亟需进一步深入研究。此外,我们课题组初步发现RCN1蛋白可能具有调节糖代谢的作用。为了探讨其作用机制,本部分也对RCN1的晶体结构进行初步研究,以促进初露端倪的功能研究。研究结果第一部分D-2-羟基戊二酸脱氢酶的初步晶体学研究(1)在原核表达体系中筛选了人源D2HGDH的全长蛋白和截短蛋白的表达条件,获得了少量可溶蛋白,并检测有酶活,但是没有获得足够量进行后续的晶体学研究。(2)表达纯化了两个来源于细菌的D2HGDH同源蛋白,Homologue 1和Homologue 2。获得了 Homologue 2的可进行衍射的单晶,并获得了分辨率为2.50A的晶体结构。(3)分析结构发现Homologue2的整体结构主要包括2个结构域:盖帽结构域和FAD结合结构域,两结构域之间形成狭缝。辅因子FAD大部分包裹于FAD结合结构域内,异咯嗪环位于FAD结合结构域和盖帽结构域形成的狭缝处,与α12和α13之间的loop共同构成酶催化活性中心。(4)Homolugue2与其对称分子形成二聚体的功能单位,每个单体分子有一段无规则loop插入对称分子FAD结合域的凹槽中。体外酶活实验证明C端介导D2HGDH的二聚化,且二聚化是为了维持FAD的高亲和力,不直接参与催化。(5)Homolugue2是金属离子依赖蛋白,其酶活可以被EDTA抑制,所含金属离子种类有待确认。(6)体外酶活实验初步验证了 Homologue2的活性中心,酶活催化的具体机制还有待进一步的研究。第二部分内质网蛋白Reticulocalbin-1的初步晶体学研究(1)利用原核表达体系表达了 hRCN1的全长以及截短蛋白,用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析纯化蛋白。(2)通过稳定性实验,我们获得了更加稳定的hRCN1截短蛋白hRCN166-331,并实现了高效表达和纯化。(3)在截短蛋白hRCN166-331基础上,通过结晶搜索获得了 hRCN166-331的晶体,但晶体衍射力很弱,尚需优化。(4)初步探索了可以影响hRCN1蛋白质聚集状态的外界因素,发现Ca2+、DTT和Mn2+有助于该蛋白产生更多单体。这些实验结果为RCN1的进一步晶体学研究奠定了坚实基础。创新点与不足之处1.创新点(1)首次报道了 D2HGDH家族蛋白的结构,该蛋白的整体结构主要包括2个结构域:盖帽结构域和FAD结合结构域,活性中心位于两结构域的狭缝中。(2)首次报道D2HGDH形成同源二聚体的意义是维持FAD高亲和力,并不参与催化。(3)首次对RCN1蛋白进行晶体结构方面的探索,获得了 RCN1的初筛晶体。2.不足之处(1)本论文第一部分报道了 D2HGDH家族一种蛋白的结构,但该蛋白的底物及其所结合的金属离子尚不明确,其催化机制也没有进行深入的探索,仍有待进一步研究完善。(2)本论文第二部分对RCN1蛋白进行了初步晶体学研究,获得了该蛋白初筛晶体,但所获晶体较小,仍需后续实验优化。