产岩藻多糖酶菌株的筛选及其酶解制备低分子量岩藻多糖的研究

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岩藻多糖是一种天然海洋功能性资源,因其复杂多变的化学组成而具有广泛的生理活性,但天然岩藻多糖分子量大难以吸收,因此需要适当的方式降低其分子量。当前,酶水解法因具有温和水解、对环境友好、产物分子量易于控制等优点成为理想的水解方法。但已知岩藻多糖酶的酶活力大多比较低,难以进行大规模的生产应用,因此寻找新的更高酶活的产岩藻多糖酶菌株成为亟待解决的重要问题。本课题旨在筛选出一株新的产岩藻多糖酶菌株,通过酶法制备不同分子量的低分子量岩藻多糖,探索酶水解对岩藻多糖生物活性的影响。本课题的主要研究内容如下:(1)从不同地区的酒厂和烟台海域采集样品,以岩藻多糖为唯一碳源,初步筛选得到70株产岩藻多糖酶的菌株。将菌株分别进行固态和液态发酵,测定岩藻多糖酶活力,发现菌株W1207在固态发酵条件下的岩藻多糖酶活力最高,为(0.32±0.01)U·mL-1。且高效凝胶渗透色谱的结果表明,该菌株来源的岩藻多糖酶可有效降低岩藻多糖分子量,并产生约为2 kDa的低分子量岩藻多糖。通过形态学和分子生物学鉴定,确定该菌株为谢瓦氏曲霉,命名为Aspergillus chevalier WA1207。(2)使用单因素法优化A.chevalier WA1207的固态发酵条件。结果表明,该菌株在麸皮10 g、岩藻多糖0.1 g、pH 5.0、含水量70%(v·w-1)、接种量2.5%(v·w-1)、培养温度35℃、培养时间5 d时的岩藻多糖酶活力最高,为(0.41±0.02)U·mL-1,较优化前提高了31.43%。(3)为进一步提高低分子量岩藻多糖得率,通过单因素和正交试验对酶水解条件进行优化。结果表明,最佳酶水解条件为底物浓度15 g·L-1、pH 6.0、酶解温度55℃、酶解时间24 h,此时低分子量岩藻多糖得率最高,为52.85%。且在水解过程中,硫酸根含量未发生变化,即在水解过程中未发生脱硫现象,表明该酶可温和水解岩藻多糖。(4)使用粗酶液在最佳酶水解条件下进行酶水解产物的批量制备。水解液经醇沉、除蛋白、透析、超滤分级、冷冻干燥后共获得四种不同分子量的低分子量岩藻多糖产物(F1、F2、F3、F4),然后对其化学组成进行分析。结果发现,四种产物均主要是由L-岩藻糖和半乳糖组成;F1、F2和F3的重均分子量比较小,均低于10 kDa,分别为1 250Da、2 505 Da和8 227 Da,F4的重均分子量比较大,为40 554 Da。(5)为验证酶水解对岩藻多糖活性的影响,分别测定水解前后样品的抗氧化活性和促益生菌生长能力。抗氧化的实验结果表明,四种产物均具有优于F0(水解前的岩藻多糖)的抗氧化活性。其中,分子量对产物的DPPH自由基清除能力的影响较小,产物之间的清除能力相差不大;在羟自由基清除能力中,分子量与产物的清除活性呈负相关。促益生菌生长实验表明,F0对三株乳杆菌的促增殖效果不明显,且在高浓度下出现了抑制,四种产物的促增殖效果较好,菌体密度均明显提高。
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