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B7-1分子是表达于抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)表面的重要共刺激分子,其受体是表达于T细胞表面的CD28。B7-1分子与CD28结合转导T细胞活化的正性共刺激信号。该信号具有促进抗原特异性T细胞增殖,分泌细胞因子,诱导效应T细胞分化及防止T细胞发生凋亡等功能。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是具有自身反应性的T、B淋巴细胞异常活化,产生自身抗体及免疫复合物等特点的自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。该病变累及全身,可造成多器官和组织的慢性病变和功能丧失。其中尤其以狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)为最严重的并发症,且是导致SLE患者死亡的主要原因。研究发现,B7-1/CD28信号通路在SLE疾病的发生发展过程中发挥重要作用,因此阻断B7-1/CD28信号通路为自身免疫性疾病SLE的干预提供了理论依据。本课题1.运用本室自行构建的能够持续稳定分泌鼠抗人B7-1双价抗体的基因工程细胞株SAШ制备并纯化双价抗体。2.根据自身免疫性疾病SLE的病理损伤机制,运用Pristane化学法诱导与人类SLE相似的C57BL/6小鼠狼疮样肾炎模型并进行鉴定。3.应用鼠抗人B7-1双价抗体对该疾病模型进行免疫干预效应及其分子机制的研究。寻找此类疾病治疗的新靶标及新手段。一、鼠抗人B7-1双价抗体的制备及生物学鉴定目的:制备鼠抗人B7-1双价抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用体外细胞大规模培养技术收集CHO细胞的培养上清,经离心及超滤等预处理,上Profinity TM IMAC镍柱进行纯化;流式细胞术分析B7-1双价抗体对细胞膜型B7-1的识别;变性及非变性条件SDS凝胶电泳对该双价抗体的双价性进行鉴定。结果:上清中抗体蛋白的得率为10mg/L;该抗体与转人B7-1基因的L929细胞、人的B淋巴瘤细胞Raji及人的T淋巴瘤细胞Jurket的结合率分别为99.3%、97.9%及9.5%;该抗体在变性及非变性条件SDS凝胶电泳得到了27 kDa及53 kDa的目的蛋白条带。结论:成功制备了鼠抗人B7-1双价抗体。二、pristane诱导小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定目的:构建pristane所致小鼠狼疮样肾炎模型并对该模型进行生物学鉴定。方法:将8周龄雌性c57bl/6小鼠随机分为2组,造模组与阴性对照组分别10只,造模组予一次性腹腔注射降植烷0.5ml/只,阴性对照组予一次性腹腔注射生理盐水0.5ml/只,造模时间为4个月。4个月时,albustix尿蛋白试纸检测小鼠尿蛋白含量;间接免疫荧光法检测血清中抗双链dna(ds-dna)抗体及抗核抗体(ana)含量;流式细胞术分析小鼠脾脏中apc、t细胞及b细胞的百分率;直接免疫荧光法检测肾小球免疫复合物(immunitycomplex,ic)沉积;he染色观察肾小球病理改变;透射电镜观察肾小球超微结构变化。结果:建模4个月时,小鼠均出现蛋白尿,蛋白严重程度为+~++,尿蛋白含量为300mg/l~1000mg/l;小鼠血清中均可检测到荧光强度较强的抗dsdna抗体和ana;小鼠脾脏中的apc、t细胞及b细胞的活化水平显著高于对照组(p<0.05);小鼠肾小球系膜上ic沉积严重;he染色结果显示,小鼠肾小球增大、肾小球囊腔不规则改变及炎症细胞浸润严重;透射电镜可见肾小球基底膜增厚,肾小球基底膜处有尖锐转角,脏层细胞及基底膜间可见大量免疫复合物沉积。结论:成功建立pristane诱导的小鼠狼疮样肾炎模型。三、b7-1双价抗体对小鼠狼疮样肾炎的免疫干预效应及分子机制研究目的:应用鼠抗人b7-1双价抗体阻断或削弱b7/cd28信号通路,对pristane所致c57bl/6小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应及可能的分子机制进行研究。方法:按第二部分的方法建模,取雌性c57bl/6小鼠随机分为4组,每组5只。对照组:参照抗体组同一时间给予等量的生理盐水;造模组:参照抗体组同一时间给予等剂量的小鼠igg同型对照;抗体组:设首次注射时间为第1天,于第1、3、5、8、15、43、71、99天分别尾静脉注射鼠抗人b7-1双价抗体10mg/kgw/只;ctx组:设首次注射时间为第1天,于第1、8、22、29、43、50、64、71、85、92天分别腹部注射ctx60mg/kgw/只。albustix尿蛋白试纸检测小鼠尿蛋白含量;间接免疫荧光法检测血清中抗ds-dna抗体及ana含量;流式细胞术分析小鼠脾脏中apc、t细胞及b细胞的百分率;he染色观察肾小球病理改变;直接免疫荧光法检测肾小球免疫复合物(ic)沉积;透射电镜观察肾小球超微结构变化。结果:抗体组小鼠尿蛋白含量较造模组显著降低;抗体组小鼠血清中抗dsdna抗体和ANA的荧光强度较造模组明显减弱;抗体组小鼠脾脏中的APC、T细胞及B细胞的活化水平显著低于造模组(p<0.05);抗体组小鼠HE染色结果显示,肾小球增大、肾小球囊腔不规则改变及炎症细胞浸润情况明显减轻;抗体组小鼠肾小球系膜上IC沉积明显减轻;抗体组小鼠透射电镜可见肾小球基底膜增厚明显减轻,脏层细胞及基底膜间IC沉积明显减少。结论:B7-1双价抗体通过阻断或削弱B7/CD28信号可降低T、B细胞的异常活化,减少自身抗体的产生,从而减轻免疫复合物对肾功能的损伤。因此B7-1双价抗体的免疫干预可逆转pristane所诱导的小鼠狼疮样肾炎的病理损伤,提示该抗体对SLE疾病的治疗具有潜在的应用价值。