副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）是一种重要的人畜共患革兰氏阴性病原菌,不仅制约着水产行业的可持续发展,造成了严重的经济损失,还对人类健康及食品安全造成了极大的威胁。脂蛋白是副溶血性弧菌细胞外膜的重要组成部分,与其基础生命活动及致病机制密切相关。细菌细胞内脂蛋白的正确装配及功能的发挥依赖脂蛋白定位系统（Localization of lipoprotein system,Lol）。Lol系统由LolA-E五个蛋白构成,分别在内膜上形成LolCD2E复合物,在周质中形成伴侣蛋白LolA,在外膜周质侧形成脂蛋白LolB。然而,现阶段Lol系统相关蛋白的三级结构与转运机制还未完全明晰,且大部分研究常基于大肠杆菌等革兰氏阴性菌。因此,本文针对副溶血性弧菌Lol系统的研究空白,通过生物信息学技术对副溶血性弧菌脂蛋白定位系统转运蛋白的结构与功能进行分析与预测,开展了副溶血性弧菌Lol系统可溶性转运蛋白及膜蛋白复合物LolCD2E的表达与纯化策略研究,并结合虚拟筛选技术开展了基于副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白的靶向小分子化合物初步筛选。具体研究内容及研究结果如下:1.副溶血性弧菌脂蛋白定位系统转运蛋白结构与功能的生物信息学分析副溶血性弧菌是一种重要的人畜共患病原菌,脂蛋白定位系统（Localization of lipoprotein system,Lol）负责该菌脂蛋白的转运与定位,与其致病力及耐药性密切相关,对Lol系统转运蛋白进行系统的生物信息学分析,有助于推动副溶血性弧菌致病与耐药机理的进一步研究。本文通过生物信息学分析技术,结合Ex PASy在线工具、Signal P 4.0 Server、TMHMM-2.0、STRING、SWISS-MODEL等软件,分析了副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白LolA-E及LolCD2E的基本性质、蛋白互作关系及三级结构。LolA和LolB为酸性亲水蛋白,含信号肽位点,无跨膜区域。LolC和LolE为碱性疏水膜蛋白,LolCD2E为中性疏水膜蛋白,LolC-E及LolCD2E均无显著的信号肽位点。蛋白相互作用网络显示:LolA-E五个蛋白的编码基因均共表达,负责脂蛋白的合成与转运,并与Bam A、Pal、Mac B、Cme C等外膜蛋白具有密切的互作关系。三级结构同源建模发现,副溶血性弧菌与大肠杆菌拥有相似的LolA和LolB结构,LolC-E含有Mac B蛋白的同源结构,赋予了该系统消耗ATP运输脂蛋白的重要功能。此外,通过序列比对发现,副溶血性弧菌LolA和LolB蛋白均存在由β折叠构成的疏水腔结构,是LolA与LolB结合并转运脂蛋白的关键区域;LolC和LolE中均存在一段保守的Hook结构,这是LolCD2E复合物与LolA结合并转运脂蛋白的关键区域。本研究为副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白的表达纯化、结构与功能的研究提供了重要的数据基础,为后续抗菌药物的研发提供了新型作用靶点。2.副溶血性弧菌Lol系统可溶性转运蛋白的表达与纯化脂蛋白转运系统可溶性蛋白LolA和LolB在脂蛋白转运过程中发挥着重要的作用,负责脂蛋白从周质空间到外膜上的正确转运,目前还未有副溶血性弧菌LolA和LolB蛋白提取纯化策略的报道。本研究选取p ET28b质粒构建了该菌LolA和LolB的表达载体,并通过大肠杆菌BL21（DE3）表达系统,成功表达并纯化了高质量LolA和LolB蛋白。经质谱鉴定,证明了所获取的蛋白确为副溶血性弧菌LolA和LolB蛋白。此外,通过探究IPTG浓度和表达温度对蛋白表达情况的影响,发现IPTG浓度的升高对LolB的表达无明显影响;诱导温度在20℃时,表达情况较好,过高或过低的表达温度不利于LolA和LolB蛋白的表达与折叠。因此,基于成本和表达效果的考量,本研究确定“0.2m M IPTG+20℃+18h”的组合为副溶血性弧菌LolA和LolB蛋白的最佳表达纯化条件,为后续副溶血性弧菌LolA和LolB功能和机制的研究提供了高质量的素材。3.副溶血性弧菌Lol系统膜蛋白复合物LolCD2E的表达与纯化LolCD2E复合物是位于内膜上的ABC转运体,负责内膜脂蛋白的提取。目前,副溶血性弧菌LolCD2E的结构与功能仍存在许多未知,高质量膜蛋白的制备一直是制约膜蛋白结构解析及其功能探究的关键瓶颈。因此,本研究首先构建了副溶血性弧菌转运系统膜蛋白LolCD2E重组表达质粒,并且筛选出三种不同的去垢剂使用方案（A8-35结合DDM、Cymal6结合DDM、Cymal5NG）,均成功提取纯化副溶血性弧菌的LolCD2E膜蛋白。通过质谱鉴定,验证了获取的高纯度蛋白确实为副溶血性弧菌LolCD2E膜蛋白。此外,进一步对所获得样品进行120KV冷冻电镜负染以及200KV冷冻电镜成像分析,结果表明:三种制备方案获得的LolCD2E样品具有纯度高、质量好、均一且无明显聚集的优点,适用于进行电镜观察,其中使用Cymal5NG制备的LolCD2E成像效果最好,适合进行高分辨率冷冻电镜的数据收集及解析。本章成功副溶血性弧菌膜蛋白LolCD2E的表达与纯化策略,获得了高质量的LolCD2E膜蛋白,可用于后续冷冻电镜解析,大大推进了副溶血性弧菌Lol系统膜蛋白复合物LolCD2E完整结构的解析及其转运功能的探究进程。4.基于Lol系统转运蛋白靶向抑菌小分子的初步筛选研究基于细菌重要蛋白转运系统进行靶向小分子药物的筛选和设计,能够有效地阻碍细菌基础生命活动,从源头上彻底扼杀细菌,使其难以产生耐药性。因此,本研究选取LolB蛋白作为结合受体,从3.9万个小分子化合物中筛选出70个与LolB蛋白具有良好结合效果的候选药物。测定了结合分值最高的前10个小分子化合物对副溶血性弧菌的抑菌效果,结果表明,在1000-200ppm浓度范围内,均能有效抑制副溶血性弧菌的生长;在100-10ppm浓度范围内,抑菌效果最明显的依次为原花青素、甜菊苷、曲克芦丁与芦丁。荧光光谱测定发现,随着化合物浓度的增大,LolB蛋白发射荧光强度呈下降趋势,产生了荧光猝灭。通过计算猝灭速率常数Kq值,表明这些化合物均能与LolB发生了静态猝灭。通过计算结合常数Ka值,发现化合物与LolB蛋白强烈结合形成了稳定的复合物,其中原花青素与LolB结合作用最为显著。进一步分析这4种化合物与LolB蛋白的相互作用位点,结果表明:这4种小分子均结合与LolB蛋白的疏水结构域内部,通过与LolB蛋白氨基酸残基形成氢键或Pi-Pi键的方式,使LolB蛋白的疏水性增强（与荧光光谱分析结果一致）,从而影响脂蛋白的转运,导致VP无法有效合成细菌外膜而死亡。本研究初步筛选获得了能够靶向作用于LolB蛋白的抑菌小分子,具有良好的抑菌活性和广阔的应用前景。总结:本研究针对副溶血性弧菌Lol系统展开研究,通过生物信息学技术系统地分析并预测了副溶血性弧菌Lol系统各相关蛋白的结构与功能,为Lol系统转运蛋白的表达、纯化与结构解析提供重要的数据支撑;构建了副溶血性弧菌Lol系统转运蛋白的表达与纯化策略,为副溶血性弧菌中Lol系统转运脂蛋白的机制提供了研究素材,所制备的高质量膜蛋白复合物LolCD2E能运用于300KV冷冻电镜的数据采集,大大推进了膜蛋白复合物LolCD2E完整结构的解析及其转运功能的探究进程;最后基于Lol系统转运蛋白筛选出了靶向抑菌小分子,并初步分析出了小分子与Lol系统转运蛋白的相互作用机制,为设计靶向结合细菌Lol系统的药物奠定了研究基础。