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枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是目前生物防治和水果保鲜中研究最多的一种有益微生物。为了探索枯草芽孢杆菌对广西重要的药食两用水果——荔枝采后病害的防治效果及其机制,本文在进行采集、分离、筛选和鉴定的基础上,对其菌株发酵液提取拮抗物质方法、产拮抗物质的发酵条件、拮抗物质的理化性质等方面进行了研究;同时,为明确枯草芽孢杆菌抗菌作用的化学机制,本研究利用激光镊子拉曼系统(LTRS)对芽孢杆菌、芽孢中的2,6-吡啶二羧酸及其不同物理形态进行了研究,为进一步了解2,6-吡啶二羧酸的结构与其在细胞芽孢的形成过程、萌发机制、抗菌物质合成等因素之间的关系提供理论依据。
本研究从健康荔枝果树叶片及根际土壤中分离得到67株芽饱杆菌,通过筛选,获得4株抑制荔枝病原菌活性较强的菌株:OR-1、OR-2、OR-3、ON-6。经过对菌株的微生物常规鉴定及分子生物学的16SrDNA检测,将4株菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。抑菌试验表明,4株枯草芽孢杆菌对荔枝霜疫霉、炭疽菌有明显抑制作用,其中ON-6菌株的抑菌活性最强,其无菌发酵液对荔枝霜疫霉和炭疽菌菌丝生长的分别为92.3%和70.3%。荔枝离体果的抗菌实验结果表明,常温下与4℃低温下4株菌株的无菌发酵液对荔枝采后病原菌具有一定的抑制作用,能够延长果实的储藏时间,延缓鲜果的褐变,其中仍以ON-6菌株的防病效果最好。
枯草芽抱杆菌ON-6菌株产拮抗物质的最佳培养条件为:碳源为葡萄糖、氮源为牛肉膏和蛋白胨、温度为32-34℃、初始pH值为7.0~7.5、培养时间为7d、装液量为25ml/250ml。对ON-6菌株发酵液采用浓盐酸沉淀法及硫酸铵沉淀法,得到的提取液均有抑菌活性,表明ON-6菌株能产生能蛋白类和脂肽类抗生物质。对该菌株的蛋白粗提液进行30-60℃处理30min,其活性保持不变,121℃处理20min,活性丧失不足原有的40%;作用活性pH值在5.0-8.0范围内;对胰蛋白酶不敏感,对蛋白酶K和胃蛋白酶部分敏感;对紫外线不敏感。
拉曼光谱研究表明,单个芽孢的拉曼光谱能够很好的反映出单个芽孢的特征信息,不同种、同种不同菌株之间的芽孢的DPA浓度有所不同,同一菌株的不同芽孢个体之间DPA浓度也存在差异。对芽孢中的吡啶二羧酸及其不同物理形态拉曼光谱的研究中发现,不同物态的DPA及Ca-DPA的拉曼光谱有很大区别,同时验证了芽孢体内的DPA是以Ca-DPA晶体的形式存在。