志贺毒素基因克隆表达及其免疫学活性研究

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 解放军军事医学科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wdkkiller
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志贺毒素是由Ⅰ型痢疾志贺菌产生的一种烈性毒素,具有细胞毒性、肠毒性和神经毒性,是痢疾继发的严重疾病如溶血性尿毒综合征、血栓性血小板减少性紫癜等的主要原因,是一种重要的生物战剂。 设计合成引物,以Ⅰ型痢疾志贺菌的基因组为模板经PCR扩增获得三条DNA序列,分别插入pMD 18-T载体,测序证明所获得的三条序列为志贺毒素A、B亚单位基因及其串联片段,与GenBank中相应序列比较,同源性分别为99.5%、100%和99.8%,通过计算机软件对所推测的氨基酸序列进行了蛋白质参数分析。 把志贺毒素B亚单位基因连接入pBV220获得了高效表达,并对表达条件进行了优化,经过超速离心、盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析,获得了纯度达97.8%的志贺毒素B亚单位,以纯化的志贺毒素B亚单位免疫昆明小鼠,可诱导机体产生多克隆抗体,免疫后的小鼠可对抗致死量的粗制志贺毒素的攻击。以纯化的志贺毒素B亚单位免疫莱航蛋鸡,可诱导产生高滴度(5.12×10~4)的卵黄抗体,并用水稀释法和盐析法对卵黄抗体进行了粗纯化。 选择志贺毒素B亚单位具有保护作用的表位合成两条多肽,免疫人体后分离外周血淋巴细胞,提取总RNA,以设计合成的引物经RT-PCR扩增人Ig Vk基因与VH基因,使用柔性Linker连接成人源单链抗体(ScFv)基因库,为构建噬菌体抗体库和筛选高亲和力抗体奠定了基础。
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