糖尿病是现今危害人类健康与生命的一大疾病。患者体重减轻、形体消瘦,严重者体重可下降数十斤,以致疲乏无力,精神不振。糖尿病也引发多种并发症,如心脏、肾脏、血管、神经、视网膜的病变,给病人带来了极大痛苦。胰岛素作为机体内唯一降血糖的激素,对于糖尿病的治疗有着极为关键的作用。市场上的胰岛素制剂,传统生产方法的主要来源是猪胰岛素、牛胰岛素。因为二者与人胰岛素的一级结构有所不同,可能会产生免疫排异,进而影响活性,且产量较低,很难满足市场供应。所以现今,以基因工程方法生产胰岛素来取代传统的方法已成为主要趋势。另一方面,糖尿病患者的主要用药方式是注射,一天多次的注射给患者带来很大不便。所以开发其它用药方式的胰岛素,如吸入、贴片、口服胰岛素也是当今研究的一个热点。本研究的目的是设计与克隆短C肽胰岛素突变体,为日后研究其活性打好基础,并探究人胰岛素原对马铃薯的遗传转化的优化条件。以美国国家基因库(Genbank)发布的人胰岛素原的氨基酸序列为模板,参考大肠杆菌表达系统的密码子偏好性和表达载体pGEX-3X的特点,设计适合大肠杆菌表达的人胰岛素原基因,并在B链N端上游添加EcoRI酶切位点,在A链C端下游添加BamHI酶切位点。C肽部分用一短四肽代替。整个基因设计成6个互相部分重叠的片段,并分段合成。T-A克隆得到人胰岛素突变体基因。另外,本实验也尝试了将实验室构建的植物表达载体p1301P06H转化农杆菌,并用几种不同方法以农杆菌介导转化马铃薯。实验的结果总结如下:(1)完成人胰岛素突变体InsM2的分子设计。(2)分段合成所设计的基因片段,使用套叠式PCR方法,结合Klenow片段处理,体外延伸获得完整的适合在大肠杆菌中表达的人胰岛素突变体InsM2的基因。并摸索出最佳扩增条件为退火温度为60℃、65℃、70℃的梯度PCR。(3)凝胶回收到经纯化的片段。片段通过粘性末端TA克隆到T载体pMD-19simpleT-Vector上。经过筛选,得到阳性菌株,经测序,结果有两个核苷酸与预期相比发生突变,但是所编码的氨基酸未发生改变。(4)分别使用马铃薯费乌瑞它的茎段、叶片、茎尖、块茎上生长的芽、以及刚刚萌发的小型马铃薯块茎作为材料,结合叶盘法、真空渗透法、超声法,对马铃薯进行转化。最终得到对费乌瑞它的转化最佳条件是使用茎尖法,抽真空到0.04MPa维持2.5min后恢复常压,重复三次,在含有乙酰丁香酮的共培养基中共培养3天,经筛选获得在含有潮霉素的抗性培养基中生根的植株,有待进一步使用分子生物学方法检验。结论:设计的人胰岛素突变体中所含的取代C肽的短四肽,它的结构是一个β转角结构,用于连接B链与A链,使胰岛素空间结构不发生改变,且缩短了C肽的长度,并使用分段合成,降低了合成的难度和成本。日后可用于表达并纯化InsM2,研究其活性,为将来使用马铃薯表达该蛋白质打下了基础。另外,使用茎尖法加上真空处理可以提高农杆菌介导的马铃薯转化的效率。