一．目的与意义脓毒症是由于微生物或其他病原体侵入人体而诱发的系统性炎症反应(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、促凝血素特异质和纤维蛋白溶解失调三位一体的一组临床综合征,主要表现为免疫机制的失调和凝血机制紊乱,是创伤、烧伤、休克、感染等临床急、危重症患者的严重并发症之一,也是诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的重要原因。脓毒症作为一种导致危重症的常见原因和对预后有严重影响的因素,一直是危重症基础和临床医学研究的重点课题。脓毒症是发生率高、病死率高、治疗费用高的病症。在美国其发病率大约以8.7%的速度增长,而在每年75万余例脓毒症新发病例中,有20多万人因脓毒症而死亡。随着免疫抑制病人增多、侵入性治疗检查的增加、微生物耐药、老年人人口的增长和人们对脓毒症认识与诊断水平的提高,目前脓毒症的病例呈上升趋势。如何降低脓毒症的发病率和死亡率是该领域基础研究所面临的巨大挑战。脓毒症在其病理机制上与格兰阴性菌的感染及其产生的内毒素(Endotoxin,ET)密切相关。ET的主要成分为脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),被认为是在细菌感染、创伤、烧伤以及休克等状态下引起细胞因子(cytokine, CK)产生的主要因素。目前较为认同的ET作用方式是可溶性LPS和LPS结合蛋白(lipopolysacchride binding protein, LBP)形成复合物,被运输到髓样细胞表面与CD14膜受体结合,启动细胞反应,产生促炎细胞因子(proinflammatory cytokine,PIC),从而导致脓毒症的发生。与此同时,机体还会释放一些抗炎细胞因子(anti-inflammatory cytokines, AICs)对这种炎症反应进行调控。如果机体丧失这种对促炎反应的早期调控,就会导致SIR的发生。脓毒症还常常伴有凝血通路和纤维蛋白溶解异常,纤维蛋白原降解产物(Fibrinogen degradation product, FDP) D-二聚体升高,活化蛋白C (activated protein C, APC)等抗凝物质下降。APC的功能是维持正常内环境稳定,但在SIRS状态下,由于凝血调节因子和内皮细胞C受体的作用,APC消耗、内皮损害,使得APC途径的功能下降,导致内环境失衡。纤维蛋白溶解系统在脓毒症过程中最终受到抑制,从而导致促凝血素特异质和纤维蛋白溶解失调。血管内皮在脓毒症的进展过程中扮演着重要角色。各种炎性介质、激活的补体系统、氧自由基、缩血管物质如血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)以及血流动力、血管应力的改变等,都会对脓毒症血管内皮造成如下一些病理改变：(1)血管被覆屏障功能减弱,血管通透性增加,造成组织水肿；同时由于血液在血管内外重新分布,导致一些重要脏器有效灌流不足,从而导致MODS的发生。(2)在脓毒症发生过程中血管内皮细胞可通过各种信号通路如MAPK信号通路、NFκB信号通路产生大量的炎性介质,形成复杂的细胞因子网络,放大炎症效应。(3)损伤的血管内皮细胞还会发生位点特异性改变,收缩因子／血管舒张因子比例失衡,加重脓毒血症,促进MODS的发生。(4)内皮下结构暴露，胶原酶释放,从而启动内源性凝血途径。内皮细胞还可释放组织因子,启动外源性凝血途径并加速凝血酶的产生。综上所述,血管内皮的损伤是脓毒血症发生、发展过程中的中心病理环节,血管内皮在炎症刺激下产生和正常血管内皮相较而言的差异分子与各种炎性介质的相互作用,进而激活各种细胞信号通路,放大对血管以及组织的损伤,是导致脓毒症发生发展的直接途径。如果存在某种在炎症条件下对血管内皮差异分子有高亲和力的短肽,这种活性短肽特异靶向于炎症条件下血管内皮,就有可能结合于某些炎症介质的结合位点从而竞争性抑制其与血管内皮细胞表面差异分子的结合,进而中和或阻断这些炎症介质发挥生物学效应,如释放炎症介质、介导细胞黏附等,从而达到阻断或减轻全身性炎症反应的发生。同时这种特异靶向性短肽还可以作为某些药物的引导肽,使这些药物具有更强的血管内皮靶向性从而更好地发挥对血管的治疗、修复和保护作用。特征性基序NTSTH就是利用LPS刺激的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)筛选M13噬菌体展示的随机环7肽库,然后通过对特异性结合环7肽测序以及生物信息学分析而得到。特征性基序NTSTH具备以下几个特征：(1)来源于人工合成的随机环7肽库。特征性基序NTSTH有可能自然存在,也有可能并非自然存在,但都有可能在人类蛋白数据库里找到其模拟的与脓毒症相关的目的功能蛋白,而特征性基序NTSTH就是其所模拟的目的功能蛋白的表位模拟肽。(2)可能对LPS刺激的血管内皮细胞具有靶向性。特征性基序NTSTH是看作是某些能够与LPS刺激的HUVEC结合的功能蛋白的共同表位,因此特征性基序NTSTH可能对LPS刺激的HUVEC具有较强的靶向性。(3)多物种同源。(4)功能上和炎症状态下的血管内皮相关。基于上述一些特点,我们首先对特征性基序NTSTH所包含的生物学信息进行进一步的挖掘,试图在人蛋白数据库里能找到其所模拟的脓毒症相关的目的功能蛋白。在经过在线局部相似性基本查询工具(basic local alignment search tool, Blast)比对及相关文献复习后,发现特征性基序NTSTH模拟了目的功能蛋白Scube 1 (signal peptide, CUB domain and EGF-like 1)的一段序列NTTTH,两者的相似性达到80%以上,具有极高的同源性,而Scube 1与脓毒症的病理过程密切相关。作为目的功能蛋白Scube 1作用于炎症状态下血管内皮的可能的模拟表位,我们在本研究中对特征性短肽NTSTH对LPS刺激的血管内皮的靶向性进行了体内、体外两方面的研究。二.方法与内容1.特征性基序NTSTH的生物信息挖掘通过Blast对基序NTSTH进行在线比对,试图能找到具有相似目的功能的同源蛋白。然后再查阅相关文献,对找出的同源蛋白进行一一筛查。NTSTH所模拟的目的功能蛋白必须具有以下特点：膜蛋白、跨膜蛋白或分泌型蛋白；多物种同源；跟炎症反应有关。对基序NTSTH生物信息进一步挖掘的目的：为NTSTH的靶向性研究和功能研究提供理论支持。2.基序NTSTH表达载体的构建和融合蛋白的表达由于基序NTSTH来自于两个噬菌体克隆,我们将这两个克隆展示的7肽连同两边的2个半胱氨酸通过基因突变的方式插入到表达载体pET14b-his-EGFP中EGFP序列的C端,这样基序仍然以环7肽的方式被his-EGFP进行标记,从而构建两个融合蛋白表达载体pET14b-his-EGFP-CNTSTHPHC和pET14b-his-EGFP-CNTSTHSLC.同时为了验证基序NTSTH所模拟的目的功能蛋白Scube 1相应的基序NTTTH是否也具有同样的靶向性,我们将NTTTH连同其两边的残基同时在其N端加一个半胱氨酸,用同样的方式构建成另外一个融合蛋白表达载体pET14b-his-EGFP-CYNTTTHRC。构建好的表达载体通过蛋白表达、纯化,得到目的融合蛋白用于后续研究。3.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC/CNTSTHSLC/CYNTTTHRC的体外结合实验人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells, HMVEC)经LPS刺激12 h后,分别加入融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC/CNTSTHSLC/ CYNTTTHRC孵育30 min,同时用未经LPS刺激的细胞以及his-EGFP处理的细胞作为对照。30 min后固定、DAPI染色并于蔡司荧光显微镜下进行观察。用专业图像软件(Image-pro plus, IPP)对荧光进行半定量分析,比较不同处理组间细胞平均染色面积(mean stained area, MSA)及平均累积光密度(mean integrated optical density, MIOD)的差异。4.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC在脓毒症休克小鼠各组织的分布于脓毒症休克小鼠尾静脉注射0.7 nmol融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC,循环10 min后用PBS灌注、多聚甲醛固定,取小鼠各脏器及组织,在小动物活体荧光观察仪下观察融合蛋白在个组织的分布情况。EGFP用以作为对照。同时取未固定的新鲜组织制作匀浆进行荧光定量和免疫印迹检测。5.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC在各组织中的具体定位于脓毒症休克小鼠尾静脉注射0.7 nmol融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC,循环10 min后用PBS灌注、多聚甲醛固定,取小鼠各脏器及组织,继续固定24 h后用28% PBS蔗糖脱水,制作冰冻切片,在蔡司荧光显微镜下观察融合蛋白在个组织血管内壁的分布情况。EGFP作为对照。6.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC的组织特异性观察12只小鼠分为三组,即CNTSTHPHC组、CNTSTHSLC组、CYNTTTHRC组。每组4只小鼠,分别给予4种不同的处理措施：模型+融合蛋白；模型+EGFP;正常+融合蛋白；正常+EGFP。分别取融合蛋白有较强靶向性的新鲜组织制作匀浆,进行荧光定量分析和免疫印迹检测,验证含有基序NTSTH／NTTTH的融合蛋白靶向于血管内皮的特异性。三.结果与分析1.特征性基序NTSTH的生物信息挖掘通过在线BLAST比对以及相关文献查阅,发现在特征性基序NTSTH模拟的目的功能蛋白中,新蛋白Scube 1合乎我们的筛查要求。Scube 1具有以下特点：(1)在小鼠、猴、斑马鱼、人类等多物种高度保守；(2)膜蛋白、分泌型蛋白；(3)最初在人脐静脉血管内皮细胞cDNA文库中发现,在人脐静脉、动脉有较强的表达；(4)与凝血过程密切相关；(5)与炎症过程密切相关,对LPS的刺激存在一种动态反应。基序NTSTH与Scube 1富含半胱氨酸的区域的一段序列NTTTH有极高的同源性。基序NTTTH有可能是Scube 1作用于活化血管内皮细胞的功能位点,因此NTSTH不仅可能靶向于血管内皮,而且可能是Scube 1参与炎症、凝血过程的一个模拟表位。2.基序NTSTH表达载体的构建和融合蛋白的表达分别构建了融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC的表达载体并对蛋白进行了表达和纯化。CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC分别以环7肽的形式用his-EGFP进行标记,增加了融合蛋白靶向于血管内皮的可能性。3.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC的体外结合实验融合蛋白在与LPS刺激的HMVEC共同孵育30 min后即可观察到蛋白在细胞膜有明显的结合,但与未经LPS刺激的细胞没有结合。作为对照,EGFP不管是与LPS刺激的HMVEC,还是未经LPS刺激的HMVEC,都不能结合。荧光半定量分析也显示融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC的MSA(F=47.761,P＜0.001)和MIOD(F=69.974,P<0.001),his-EGFP-CNTSTHSLC的MSA(F=36.802,P＜0.001)和MIOD(F=32.031,P<0.001)以及his-EGFP-CYNTTTHRC的MSA(F=19.099,P<0.001)和MIOD(F=30.640,P＜0.001)均显著高于对照组,这说明融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC和HMVEC的结合是特异性的。4.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC在脓毒症休克小鼠各组织的分布小动物活体荧光仪显示：融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC主要分布于肝、肾、脑、小肠等血管化的组织；融合蛋白his-EGFP-CYNTTTHRC只在肝、肾的分布比较明显；融合蛋白his-EGFP-CNTSTHSLC除了在肝、肾、脑、小肠有较强的分布外,还明显分布于肺组织。所有的融合蛋白在血管化的组织中都有较强的分布,而在非血管化的组织如肌肉、皮肤的分布则相对较少。组织匀浆的荧光定量以及免疫印迹分析也显示出类似的结果。这说明融合蛋白的分布可能主要跟各组织的血管化程度有关。5.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC在各组织中的具体定位各个组织的冰冻切片在荧光显微镜下观察,发现融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC、his-EGFP-CNTSTHSLC以及his-EGFP-CYNTTTHRC在各组织的定位主要是血管内皮,而在血管周围组织、组织细胞间隙、脂肪组织分布较少。融合蛋白在血栓内亦有较强的分布。6.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC的组织特异性观察组织匀浆荧光定量分析以及免疫印迹显示：融合蛋白在LPS诱导的脓毒症休克小鼠的肝、肾组织中有较强的结合,而在正常小鼠各组织中仅有非常微弱的结合；而作为对照的EGFP不管是模型小鼠还是正常小鼠,在各组织中均没有结合。说明融合蛋白对于LPS诱导的脓毒症休克小鼠的靶向性结合是特异性的。四.结论1.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC可以靶向于脓毒症休克小鼠血管化的组织。2.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC在脓毒症休克小鼠各组织中主要定位于血管内皮。3.融合蛋白his-EGFP-CNTSTHPHC／CNTSTHSLC／CYNTTTHRC与脓毒症休克小鼠各组织中血管内皮的结合是特异性的。4.环7肽CNTSTHPHC.CNTSTHSLC.CYNTTTHRC含有的共同基序NTS TH／NTTTH为融合蛋白与脓毒症休克小鼠血管内皮的作用位点,融合蛋白的结合活性与共同基序两侧的残基无关。5.特征性短肽NTSTH／NTTTH能够特异性地靶向于LPS刺激下的血管内皮。6.用his-EGFP标记的环7肽特异性靶向于血管内皮,表明其共同基序NTSTH／NTTTH具有作为大分子药物前导肽或者具有治疗作用的药物分子潜在可能性。7.特征性基序NTSTH是功能蛋白Scube 1的一个模拟表位,而NTTTH则是Scubel的一个功能位点。8.特征性短肽NTSTH／NTTTH对脓毒症休克小鼠血管内皮具有高亲和力,表明对其模拟的目的功能蛋白Scube 1可能具有竞争性抑制作用,但这需要进一步证实和研究。