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研究背景与目的： 慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia CML）是一种原发于多能造血干细胞的恶性克隆性疾病，第9号与第22号染色体相互易位形成Ph染色体是其肿瘤恶性克隆性标志。Ph染色体是9q34上的具有酪氨酸激酶（PTK）活性c-Abl基因与22q11上的Bcr（breakpoint cluser region）基因断裂后重组，形成融合癌基因Bcr／Abl，其转录翻译P210bcr/abl蛋白具有比c-Abl基因更强PTK性的，该蛋白具有促增殖、抗凋亡、抗粘附等作用，是导致CML发生和发展的最主要的病理基础。目前有实验研究表明Bcr是bcr／abl的负调控基因，其表达可以抑制P210bcr／abl蛋白功能，Bcr蛋白的第354氨基酸丝氨酸磷酸化是Bcr抑制bcr／abl活性的关键，另外，在Bcr基因部分，存在一个GRB2的SH2结合位点，该位点的Tyr177磷酸化后，可以诱导Gab2磷酸化，进而导致RAS通路的激活，参与了细胞的增殖。为了证实Bcr对bcr／abl的负调控作用机制，我们构建了短片断的Bcr基因的真核表达载体，并包含Bcr蛋白的第354位氨基酸丝氨酸磷酸化位点；以目的基因转染K562细胞后，观察目的基因对K562细胞增殖与凋亡的影响，是否具有Bcr全长基因的功能，如能获得稳定转染的细胞株，将为后续的Bcr基因和Bcr与bcr／abl基因相互作用打下基础，并验证我们曾提出的理论假设之一：bcr／abl在正常造血干细胞中表达、诱导Bcr表达或表达增高，通过Bcr表达或高表达诱导bcr／abl表达阳性的造血干细胞发生凋亡，揭示CML病程演进中的分子机理，同时为CML的分子靶治疗提供理论依据。 方法：从健康人外周血中分离单个核细胞，采用PCR法克隆目的基因Bcr片断，构建在哺乳动物细胞中表达的带有Bcr基因绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-Bcr系统；采用脂质体转染技术介导重组Bcr基因Bcr基因绿色曳光蛋白表达载体的构建及对K562细胞的影响在k562细胞表达;荧光显微镜观察和流式细胞仪（FACS）检测转染效果和转染率。G418筛选转染的阳性克隆（转染空载体PEGFP一Nl的K562细胞命名为K562trol，转染PEGFP一Bc:命名为K562eGFP一bo‘）;westem一Blot鉴定K562eGFI，一bCr基因表达蛋白;M竹法测定K562control和K562eGFP一bcr细胞增殖能力。八』nexin.v/pl双染实验、流式细胞仪、Heoechst33258染色后及nN户dadde:方法检测K562con，rol和K562eGFP一ber细胞凋亡情况。 结果:构建的重组质粒为短片断的Bcr基因绿色荧光表达载体，大小为5.skb，其中目的基因片断长843帅（包含BcR蛋白的第354位氨基酸丝氨酸磷酸化），经酶切鉴定和DNA测序鉴定证明构建正确无误。FACS检测Ber基因的荧光转染率为n%士2.5%。从W七stem一Blot结果表明短片断的Bcr基因表达为37KD蛋白质。K562eGFP·bcr细胞在体外培养48小时后增殖开始下降，72小时后细胞增殖下降较明显。荧光显微镜观察在体外培养48小时后出现形态变化，72小时后呈典型的凋亡特征，经Annexin.V/Pl双染实验、流式细胞仪、Heoechst33258染色及DN户dadde:检测证实K562eGFP一bcr细胞发生凋亡。 结论:本研究通过构建带有短片断的Ber功能基因增强型绿色荧光蛋白表达载体，转染短片断Bcr目的基因在K562细胞中，Bcr目的基因表达的蛋白分子量为37KD。短片断Ber基因在K562细胞中表达，，能诱导K562细胞增殖力下降，凋亡加速，论证了Bcr基因是bcr/abl基因的负调控基因;同时也证实了包含Bcr蛋白的第354位氨基酸丝氨酸磷酸化在抑制bcr/abl活性的起到了重要作用。为CML发病机理、分子病理演进和靶向治疗提供了理论依据。