论文部分内容阅读
目的：以大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤为动物模型，观察咯利普兰(Rolipram)对学习记忆障碍的保护作用及己酮可可碱(Pentoxifylline，PTX)对脑缺血后海马区新生细胞存活的影响，并在此基础上探讨磷酸二酯酶抑制剂的作用机制。体外培养海马神经元和PC12细胞，建立缺氧/再给氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)损伤模型，观察咯利普兰对细胞形态及细胞活力的影响。
方法：(1)咯利普兰(1mg/kg)连续腹腔给药15d，参照LongaEZ线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。造模后d8、d13分别对大鼠进行Morris水迷宫测试训练和避暗测试。造模后d15，断头取脑并迅速取出海马组织，制备成组织匀浆，应用高效液相色谱分析(HPLC)法测定海马组织磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)活性。(2)体外培养海马神经元和PC12细胞，分别应用物理、化学两种方法建立细胞H/R损伤模型，观察细胞形态学改变，并且应用四甲基偶氮唑蓝法(methylthiazolyltetrazolium，MTT)观察不同浓度咯利普兰对细胞活力的影响，测定细胞外液乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)浓度。(3)建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，造模9d后给予BrdU(50mg/kg)进行标记，4次/d，间隔2h给药1次。标记后d7腹腔注射不同剂量的PTX(20mg/kg或40mg/kg)，连续22d。在BrdU标记后d30处死大鼠。取脑组织做冷冻切片，行免疫组化法观察PTX对大鼠缺血再灌注后脑组织海马齿状回BrdU阳性细胞数的影响。
结果：(1)在Morris水迷宫测试中，各组大鼠在d1的潜伏期没有显著差异；d4与d7模型组大鼠的潜伏期明显延长，分别为27.700±13.407s、14.540±4.408s；咯利普兰显著缩短了模型大鼠的寻台时间，潜伏期分别为15.945±8.791s、10.347±3.940s。大鼠在Morris水迷宫中到达平台的平均路程在d4与d7均有显著差异：模型组大鼠的泳程分别为262.078±181.067cm、139.873±31.063cm；咯利普兰组的泳程为125.292±45.707cm、110.545±14.567cm较模型组显著缩短。在避暗实验中，模型组大鼠的潜伏期显著降低(110.563±61.817s)，错误次数显著增加(1.125±0.991次)；咯利普兰显著增加了模型大鼠的潜伏期(168.500±60.564S)，错误次数显著减少(0.750±0.707次)。通过HPLC检测分析得知：与正常对照组相比，模型组大鼠海马组织PDE4活性显著升高(34.338±7.974μmol/g/min)；与模型组相比，咯利普兰组PDE4活性显著降低(26.913±7.105μmol/g/min)。(2)结合海马神经元在倒置显微镜下的形态学特征及神经微丝(NF200)抗原的鉴定结果，确认分离培养的为神经元。缺氧/再给氧损伤后，细胞形态发生了一定的改变，咯利普兰10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L三个剂量均显著降低了缺氧/再给氧损伤对PC12细胞及海马神经元造成的损伤：PC12细胞的A值由模型组的0.287±0.080增加到0.391±0.096、0.396±0.104、0.425±0.080；神经元的A值由0.155±0.043增加到0.236±0.041、0.244±0.089、0.253±0.054。与模型组506.658±28.412相比，应用咯利普兰后PC12细胞各组细胞外液LDH也逐渐降低呈浓度依赖趋势LDH分别为472.284±27.442、448.551±24.684、437.320±41.231；咯利普兰显著减少了海马神经元细胞外液LDH值，从模型组的531.790±70.054U/L分别减少为404.460±89.568U/L、399.372±88.476U/L、388.428±127.281U/L。(3)在倒置显微镜下观察成年大鼠脑缺血损伤后海马齿状回BrdU免疫阳性细胞的分布。BrdU免疫阳性细胞表现为椭圆形或不规则形状的细胞核，并呈现明显的“丛集”现象。本实验中阴性对照海马齿状回(Dentategyrus，DG)区未见BrdU免疫阳性细胞。BrdU给药30d后，空白对照组大鼠DG区仅见少量散在的BrdU免疫阳性细胞，细胞百分比率为(100.000±18.365)，方差分析结果显示：与空白对照组相比，模型组DG区BrdU免疫阳性细胞比率显著增加为(129.358±18.378)，可可碱对照组免疫阳性细胞比率也有少量增加(108.217±15.743)；与模型组相比，PTX20mg/kg、40mg/kg治疗组BrdU免疫阳性细胞比率显著增加，分别为(148.017±24.201、152.992±22.160)。
结论：磷酸二酯酶4抑制剂—咯利普兰可显著改善局灶性脑缺血再灌注损伤造成的学习记忆障碍，推测其作用机制与抑制损伤大鼠海马区PDE4活性有关：PDE4活性降低使环磷腺苷(cyclicAdenosinemonophosphate，cAMP)水解减少，结果导致细胞内cAMP水平升高，进而活化蛋白激酶A(PKA)，导致转录因子cAMP效应元件结合蛋白(CREB)活化，最终触发基因表达和随后的蛋白质合成，从而改善H/R损伤引起的学习记忆功能障碍；离体细胞实验表明咯利普兰对海马神经元及PC12细胞缺氧/再给氧损伤具有保护作用；磷酸二酯酶抑制剂—己酮可可碱可提高局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马DG区新生细胞的存活，这也可能是PDE抑制剂具有保护脑缺血再灌注损伤的药理作用机制之一。