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药用真菌杨树菇中分离纯化得到的混合组分Yt具有较强的抗肿瘤活性,是通过杀伤肿瘤细胞和刺激免疫双重起作用。本研究假设Yt具有调节机体免疫的活性,有可能具有佐剂增强疫苗免疫效果的作用。在本论文中,对Yt作为灭活禽流感病毒H9N2免疫佐剂的效果进行了研究,进一步分离鉴定了蛋白质亚组分Yp是Yt中有免疫佐剂效应的有效成分,并最终鉴定了具有免疫佐剂效应的单一组分AAL。杨树菇混合组分Yt作为灭活禽流感病毒H9N2免疫佐剂的实验表明,0.2mg/mLYt处理组小鼠血清中的IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),增长了36.2％;0.5mg/mL Yt处理组P/N值的平均值与无佐剂组相比差异显著(P＜0.05),增长了32.4％。
以上数据表明Yt对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgGl和IgG2a含量进行检测的结果表明,1mg/mL Yt、0.5mg/mL Yt、0.2mg/mL Yt处理组小鼠血清中IgG1 P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了144.1％、167.2％、196.9％。Yt各浓度处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取Yt各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞,体外用H9N2病毒刺激,检测细胞分泌IFN-γ的量。0.5mg/mL Yt处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子的量为244.53pg/mL,与生理盐水组相比差异显著(P＜0.05)。Yt体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明,0.625μg/mLYt、1.25μg/mLYt与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率分别为210.8％和187.5％,与未处理组之间差异极显著(P＜0.01)。这些结果表明,Yt可能是通过激活脾淋巴细胞增殖,促进Th2细胞活性,从而发挥免疫佐剂作用。
通过对混合组分Yt中的有效组分进行分离鉴定,将Yt分为蛋白质组分Yp和小分子组分Ys,分别占Yt组分的60％和40％。通过对Yp和Ys组分进行免疫佐剂活性的鉴定,实验结果表明,各浓度的Ys处理组小鼠血清中IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比没有表现出显著差异,说明Ys不是Yt中具有免疫佐剂活性的有效组分。亚组分Yp作为禽流感病毒H9N2免疫佐剂的实验表明,0.5mg/mL Yp、0.2mg/mL Yp、0.1mg/mL Yp处理组小鼠血清中的IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了39.2％、47.2％、24.1％。以上数据表明Yp对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgGl和IgG2a含量进行检测的结果表明,0.5mg/mL Yp、0.1mg/mL Yp处理组小鼠血清中IgG1 P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了201.1％、274.7％。Yp各处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取Yp各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞,体外用H9N2病毒刺激,检测细胞分泌IFN-γ的量。0.5mg/mLYp处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ的量为146.21pg/mL,与生理盐水组相比差异显著(P＜0.05)。Yp亚组分体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明,0.625μg/mL Yp、1.25μg/mL Yp、2.5μg/mLYp与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率分别为265.4％、321.1％和347.1％,与未处理组之间差异极显著(P＜0.01)。这些结果表明,亚组分Yp是Yt中具有免疫调节活性的有效活性组分,免疫调节活性与Yt相似,可以促进淋巴细胞增殖,促进Th2亚群细胞活性。
以前的研究结果表明半乳糖凝集素AAL是Yp中的主要成分,因而对AAL作为禽流感病毒H9N2免疫佐剂的效果进行了研究,结果表明,0.2mg/mL AAL、0.1mg/mL AAL处理组小鼠血清中IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了98.01％和157.5％。结果表明AAL对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgG1和IgG2a含量进行检测的结果表明,0.5mg/mL AAL、0.2mg/mL AAL、0.1mg/mL AAL处理组小鼠血清中的IgG1 P/N值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了399.1％、362.3％、251.6％。AAL各处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取AAL各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞,体外用H9N2病毒刺激,检测细胞分泌IFN-γ的量。0.05mg/mL AAL处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ的量为174.64pg/mL,与阴性对照无佐剂组相比差异显著(P＜0.05)。AAL体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明,12.5μg/mL AAL与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率为134.1％,与未处理组之间差异极显著(P＜0.01);6.25μg/mLAAL与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率为131.2％,与未处理组之间差异显著(P＜0.05)。由此可见单一组分半乳糖凝集素AAL是杨树菇中具有免疫佐剂效应的主要成分。
综上所述,通过对杨树菇提取物Yt,其蛋白质亚组分Yp、单一组分AAL免疫佐剂效应的鉴定,确定Yt、Yp和AAL都具有佐剂活性,它们通过刺激淋巴细胞增殖,促进Th2亚细胞活性,增强抗原的免疫原性,提高抗原免疫的抗体滴度。
以上数据表明Yt对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgGl和IgG2a含量进行检测的结果表明,1mg/mL Yt、0.5mg/mL Yt、0.2mg/mL Yt处理组小鼠血清中IgG1 P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了144.1％、167.2％、196.9％。Yt各浓度处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取Yt各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞,体外用H9N2病毒刺激,检测细胞分泌IFN-γ的量。0.5mg/mL Yt处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子的量为244.53pg/mL,与生理盐水组相比差异显著(P＜0.05)。Yt体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明,0.625μg/mLYt、1.25μg/mLYt与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率分别为210.8％和187.5％,与未处理组之间差异极显著(P＜0.01)。这些结果表明,Yt可能是通过激活脾淋巴细胞增殖,促进Th2细胞活性,从而发挥免疫佐剂作用。
通过对混合组分Yt中的有效组分进行分离鉴定,将Yt分为蛋白质组分Yp和小分子组分Ys,分别占Yt组分的60％和40％。通过对Yp和Ys组分进行免疫佐剂活性的鉴定,实验结果表明,各浓度的Ys处理组小鼠血清中IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比没有表现出显著差异,说明Ys不是Yt中具有免疫佐剂活性的有效组分。亚组分Yp作为禽流感病毒H9N2免疫佐剂的实验表明,0.5mg/mL Yp、0.2mg/mL Yp、0.1mg/mL Yp处理组小鼠血清中的IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了39.2％、47.2％、24.1％。以上数据表明Yp对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgGl和IgG2a含量进行检测的结果表明,0.5mg/mL Yp、0.1mg/mL Yp处理组小鼠血清中IgG1 P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了201.1％、274.7％。Yp各处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取Yp各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞,体外用H9N2病毒刺激,检测细胞分泌IFN-γ的量。0.5mg/mLYp处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ的量为146.21pg/mL,与生理盐水组相比差异显著(P＜0.05)。Yp亚组分体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明,0.625μg/mL Yp、1.25μg/mL Yp、2.5μg/mLYp与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率分别为265.4％、321.1％和347.1％,与未处理组之间差异极显著(P＜0.01)。这些结果表明,亚组分Yp是Yt中具有免疫调节活性的有效活性组分,免疫调节活性与Yt相似,可以促进淋巴细胞增殖,促进Th2亚群细胞活性。
以前的研究结果表明半乳糖凝集素AAL是Yp中的主要成分,因而对AAL作为禽流感病毒H9N2免疫佐剂的效果进行了研究,结果表明,0.2mg/mL AAL、0.1mg/mL AAL处理组小鼠血清中IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了98.01％和157.5％。结果表明AAL对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgG1和IgG2a含量进行检测的结果表明,0.5mg/mL AAL、0.2mg/mL AAL、0.1mg/mL AAL处理组小鼠血清中的IgG1 P/N值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P＜0.01),分别增长了399.1％、362.3％、251.6％。AAL各处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取AAL各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞,体外用H9N2病毒刺激,检测细胞分泌IFN-γ的量。0.05mg/mL AAL处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ的量为174.64pg/mL,与阴性对照无佐剂组相比差异显著(P＜0.05)。AAL体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明,12.5μg/mL AAL与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率为134.1％,与未处理组之间差异极显著(P＜0.01);6.25μg/mLAAL与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率为131.2％,与未处理组之间差异显著(P＜0.05)。由此可见单一组分半乳糖凝集素AAL是杨树菇中具有免疫佐剂效应的主要成分。
综上所述,通过对杨树菇提取物Yt,其蛋白质亚组分Yp、单一组分AAL免疫佐剂效应的鉴定,确定Yt、Yp和AAL都具有佐剂活性,它们通过刺激淋巴细胞增殖,促进Th2亚细胞活性,增强抗原的免疫原性,提高抗原免疫的抗体滴度。