目的：　　外周炎症可以导致脊髓后角神经元(dorsal root ganglia，DRG)和三叉神经节(trigeminal ganglia，TG)中μ阿片受体（μ-opioid receptor，MOR）表达变化。大鼠后爪注射完全弗氏佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）诱导炎症可以导致DRG中MOR mRNA和蛋白表达明显增加。深部组织炎症，例如内脏组织和肌肉组织炎症，也能增加神经节中的MOR表达。然而，感觉神经元中调节MOR的细胞机制以及炎性状态下参与的调节因子机制尚无系统报道。现有的研究表明细胞因子比如白介素(interleukin，IL)-1β，IL-4，IL-6和肿瘤坏死因子α(TNFα)能够诱导神经细胞系和非神经细胞系中MOR表达变化。但是细胞因子是否参与调节初级感觉神经元中MOR表达未见报道。　　系统给予阿片药物的镇痛作用在动物和人体中都存在性别差异。阿片药物镇痛作用的性别差异机制包括细胞内信号传导机制，性激素和基因的作用机制等。大量研究表明不同中枢神经系统中阿片受体密度的性别差异是阿片药物镇痛作用性别差异的基础。在外周，下颌关节中局部注射吗啡能够缓解雄性大鼠下颌关节运动疼痛，但对雌鼠无效;同时在内脏痛疼痛模型中雄鼠外周MOR兴奋缓解疼痛的效果明显优于雌鼠。但是，外周MOR介导疼痛的性别差异机制尚不清楚。　　由此我们假设炎性因子调节感觉神经元中MOR表达具有性别差异，从而导致阿片药物外周用药的性别差异。本实验中，我们采用口面部肌肉炎症的大鼠疼痛模型，以研究(1)炎症导致MOR表达变化是否具有性别差异:(2)炎性细胞因子，特别是IL-1β，IL-6和TNF-α，在调节三叉神经节(trigeminal ganglia，TG)中MOR表达的作用;(3)细胞因子对MOR表达的调节是否与性激素有关;(4)在炎性状态下MOR表达的性别差异是否与外周给予MOR激动剂的镇痛效果差异有关。　　方法：　　本研究使用年龄相当的成年雄性、雌性、切除睾丸雄性大鼠(GDX)和切除卵巢(OVX)的雌性大鼠进行实验。　　1、炎性疼痛模型　　3％异氟醚吸入麻醉后采用27G针头在咬肌中部注射50μl50％ CFA产生炎性疼痛模型。　　2、三叉神经节培养　　处死大鼠双侧TG迅速取出后置于冰冻的HBSS溶液中，显微镜下去除神经节外膜。每个神经节纵形均分成两半。每半个TG撕裂成3片后放在12孔的培养皿中，并倒入1ml培养液。在37℃C和5％ CO2孵箱中培养48小时后加入不同的细胞因子或对照溶剂孵育。　　3、Real-Time RT-PCR　　炎症组大鼠分别在CFA注射后1天，3天和7天取TG，未处理对照组大鼠直接取TG进行培养后细胞因子或对照溶剂处理4小时，采用RT-PCR测定MORmRNA水平。　　4、Western blotting　　蛋白来自未处理的雄性和雌性大鼠TG，以及咬肌注射CFA后1天和3天的雄性和雌性大鼠TG，采用Western blotting测定MOR蛋白水平。一抗即从兔中提取的抗MOR，二抗即HRP相关联的抗兔抗体。　　5、行为学测定　　本研究中采用大鼠咬肌感觉特异的行为学检测方法。在该模型中，用von Freyfilament（感觉测试器）测定咬肌部位皮肤区域感觉。这种仪器是由不同弯曲强度的细丝组成，手持刺激物缓慢接近大鼠。动物的阳性反应包括:面部搔抓，后退动作或攻击行为。每种细丝刺激5次，得到阳性反应频率（阳性反应/总刺激次数*100％）。非线性回归分析后得到EF50值（50％有效值），用着机械刺激反应阈值。炎症后EF50值降低提示机械性疼痛过敏。　　注射CFA前1天，注射后第1，2，3天对大鼠进行机械刺激反应阈值测试。MOR激动剂，酪氨酸-D-丙氨酰-甘氨酰-N-甲基-苯并氨酰-甘氨酰-醇-脑啡肽乙酸盐(DAMGO)，对大鼠机械刺激反应阈值的影响在CFA注射后第3天进行，因为CFA注射后第3天机械性感觉过敏。CFA注射后第3天，DAMGO(10μg，20μl)或同样体积的生理盐水对照液注射到咬肌中。药物注射后30min进行机械刺激反应阈值测试。DAMGO剂量选择是根据我们既往实验，该剂量DAMGO仅作用与外周MOR，而非中枢MOR。本实验采用盲法，机械刺激反应阈值测试者不知道实验的分组。　　6、细胞因子和药物的准备和给予　　TG培养中，IL-1β，IL-6，TNF-α和可溶重组小鼠IL-6受体都用磷酸盐缓冲液(PBS)中溶解。IL-1β，IL-6，TNF-α和可溶重组小鼠IL-6受体分别加入培养液中，最终浓度为100 ng/ml。含细胞因子的培养液温暖到37℃后放入TG中并孵育4小时。　　PBS溶解重组人IL-1受体拮抗剂和IL-6受体拮抗剂重组人gp130。细胞因子拮抗剂的最终浓度为2μg/20μl，在CFA注射前30min注射到雄鼠咬肌中。为保证药物注射到咬肌的同一区域，在颧骨和下颌角之间触摸咬肌。所有药物注射采用27G并持续5-10秒。3天后测定TG中MOR mRNA水平。　　7、睾酮给予　　睾酮溶解在红花油中，每天早上9:00-11:00睾酮16mg/kg/100μl皮下注射到GDX大鼠中，连续7天。在最后一次睾酮注射后4小时收集GDX大鼠TG进行培养，细胞因子处理后进行RT-PCR分析，方法同前。　　结果：　　1、炎症诱导TG中MOR表达具有性别差异　　雌雄大鼠TG中MOR mRNA水平无明显差异(t=1.03，p=0.34)。CFA诱导咬肌炎症后雄鼠TG中可产生时间依赖的MOR mRNA水平增加，而雌鼠TG中MOR mRNA水平无明显增加。咬肌注射CFA后第1，3天雄鼠TG中MOR mRNA水平明显增加(H=13.84，p=0.003)。一侧咬肌注射CFA后，注射对侧TG中MOR mRNA水平无明显增加。　　咬肌注射CFA后第1，3天在雄鼠TG中MOR蛋白水平明显增加(H=9.2，p＜0.05)，与MOR mRNA水平吻合。雌鼠TG中MOR蛋白水平在CFA注射后仅有轻度变化，CFA注射后第1天MOR蛋白水平下降，但是注射后第3天MOR蛋白水平无明显变化(H=6.2，p＜0.05)。　　2、IL-1β，IL-6和TNF-α对MOR表达的影响　　雄鼠TG器官培养中加入TNF-α，IL-1β或IL-6+IL-6受体亚单位后MORmRNA水平明显增高(F=8.9，p＜0.001)。同样浓度的炎性细胞因子不能引起雌鼠TG器官培养中MOR mRNA水平无明显变化(F=0.64，p=0.6)。　　IL-1RA和gp130注射明显阻断雄鼠炎性状态下引起MOR mRNA水平增高(H=14.2，p=0.03)。同样方法，注射PBS不能阻断雄鼠炎性状态下引起MORmRNA水平增高。　　3、IL-1β，IL-6和TNF-α导致MOR表达增加需要睾酮参与　　将炎性细胞因子加入GDX雄鼠TG器官培养中孵育后，MOR mRNA水平无明显变化，除IL-1β使MOR mRNA水平轻度下降(F=3.1，p=0.05)。当GDX雄鼠体内注射睾酮替代治疗7天后，取TG进行器官培养，将炎性细胞因子加入孵育后，MOR mRNA水平明显增加（H=13.1，p=0.004）。同样方法，将炎性细胞因子加入OVX雌鼠TG器官培养中孵育后，MOR mRNA水平无明显变化(F=0.62，p=0.6)。　　4、外周MOR功能差异是咬肌中疼痛过敏性别差异的原因　　雌雄大鼠疼痛阈值基础值无明显差异（59.9±2 g和55.1±3.98 g）。肌肉内注射CFA后3天雌雄大鼠疼痛阈值均明显降低。在疼痛阈值降低雌雄大鼠中注射空白对照剂疼痛阈值无明显变化（时间:F=76.5，p＜0.001;性别:F=2.4，p=0.162）。相反，在疼痛阈值降低雄鼠中注射DAMGO后疼痛阈值明显增加，而在雌鼠中无作用（时间:F=95.3，p＜0.001;性别:F=20.3，p＜0.001）。同样的方法，在疼痛阈值降低GDX雄鼠中注射DAMGO或空白对照剂后疼痛阈值无明显作用（时间:75.2，p＜0.001;药物:F=1.2，p=0.29）。　　结论：　　炎性疼痛模型中，雄鼠TG中MOR表达增加，而雌鼠TG中MOR表达无明显变化。炎性细胞因子引起雄鼠TG器官培养中MOR表达增加，而雌鼠TG器官培养中MOR表达无明显变化。炎性疼痛中睾酮在调节TG中MOR表达具有重要作用。外周MOR激动剂效果的性别差异部分原因是外周MOR表达的性别差异。