目的:雄黄（Realgar）含砷,是国务院在《医疗用毒性药品管理办法》中特别规定的28种毒性中药之一。雄黄主要成分为二硫化二砷或四硫化四砷（As2S2或As4S4）,还含有少量三氧化二砷（As2O3,i AsⅢ,即砒霜）。As2S2或As4S4在胃肠道中不易被吸收而直接从粪便中排出,而i AsⅢ易被胃肠道吸收,是雄黄的毒性成分。雄黄中的砷属于有毒类金属,且为世界公认的致癌物,砷的积累是雄黄产生毒副作用的主要原因。大量的雄黄或含雄黄制剂中毒事件都是由于过量、长期使用和加工不当而引起的。所以雄黄及其复方制剂应用的安全性问题一直饱受争议。肝脏是药物代谢的主要器官,同时也最易受到药物毒性的损害。近年来,由中药引起的肝损伤的报道日益增多。有研究表明雄黄具有明显的肝毒性。寻找雄黄诱导肝损伤的生物标志物对早期采取有效措施预防雄黄诱导的肝损伤及指导临床合理用药,具有重要的理论和现实意义。代谢组技术是目前广泛用于生物标志物筛选的主要技术,是系统生物学的重要组成部分。胆汁酸是胆汁的主要脂质成分,是一类胆烷酸的总称,能促进脂类的吸收与消化,并作为信号分子参与机体的多种代谢,其质与量的变化为肝脏疾病的诊断、鉴别及发病机制的研究提供极具价值的信息,同时胆汁酸代谢网络的研究对药物性肝损伤机制的研究和肝保护的药物筛选、评价等具有重要意义。因此,本研究建立超高效液相色谱-质谱联用技术（ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry,UHPLC-MS/MS）法测定小鼠肝组织、血浆中14种胆汁酸的分析方法。应用靶标代谢组学策略研究暴露于0.15、0.45、1.35g/kg雄黄8周的小鼠肝组织和血浆中胆汁酸谱代谢特征的变化,阐明雄黄诱导肝损伤的胆汁酸生物标志物。研究方法:1.小鼠雄黄诱导肝损伤模型的建立:雄性昆明小鼠（kunming mice,KM小鼠）（体重20-30 g）36只,按体重随机分为对照组和低、中、高剂雄黄染毒组,每组9只。对照组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠（carboxy methyl cellulose-Na,CMC-Na）;低、中、高剂量雄黄组分别灌胃给予雄黄混悬液（0.5%CMC-Na为混悬介质）0.15 g/kg、0.45 g/kg、1.35 g/kg,连续灌胃8周后处死取肝脏和全血,制备血浆。2.砷含量的测定:取肝组织约50 mg或全血100μL,加入浓硝酸消化24 h,离心,上清液稀释加入抗坏血酸、硫脲还原后,采用原子荧光光度仪测定砷含量。3.谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、血清总胆固醇（total cholesterol,TC）和总胆汁酸（total bile acids,TBA）测定:取血浆或肝组织匀浆液100μL,按试剂盒说明书操作。4.肝脏病理形态观察:苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,H&E染色法）。5.肝组织氧化损伤参数测定:取肝组织制备成10%的组织匀浆,按试剂盒说明书操作测定丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（catalase,CAT）水平。6.肝组织和血浆中14种胆汁酸分析方法的建立及方法验证:UHPLC-MS/MS法。7.肝组织中胆汁酸代谢相关基因的测定:采用实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）检测胆汁酸代谢相关的基因（胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase,Cyp7a1）、胆汁酸盐输出泵（bile salt export pump,Bsep）、牛磺胆酸钠协同转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide,Ntcp）、多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein2,Mrp2）、法尼醇X受体（farnesoid X receptor,Fxr））表达水平。8.生物信息学:肝组织和血浆中胆汁酸浓度数据采用Metabo Analyst平台进行偏最小二乘法判别分析（partial leastsquares discriminant analysis,PLS-DA）观察各组分离情况。T检验（student’s t-test）用于组间差异分析。筛选同时满足投影值的可变重要性（variable importance for the projection,VIP）>1且P<0.05的胆汁酸作为候选标志物。应用SPSS软件对各样本进行相关性分析;采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic,ROC）评价胆汁酸生物标志物诊断雄黄所致肝损伤的准确率。9.统计分析:本研究所有数据采用SPSS 17.0统计软件,进行统计分析。实验数据均以均数±标准误（mean±SEM）表示。使用未配对的t检验和方差分析检验用来比较雄黄低、中、高剂量染毒组与对照组的各胆汁酸表达水平。P<0.05时差异有统计学意义。结果:1.对照组小鼠肝组织和全血中未检测到砷。低、中、高剂量组小鼠的肝砷和血砷含量均明显高于对照组,有显著性差异（P<0.01）。2.各组小鼠体重随饲养时间逐渐增加,肝脏脏器系数有下降的趋势。雄黄染毒组小鼠血浆中ALT活力呈上升的趋势,血浆中AST活力呈现先降低后升高的趋势,血浆中TC、TBA浓度有上升的趋势。病理学研究结果显示雄黄暴露可引起小鼠肝组织形态学发生明显变化。3.与对照组相比,雄黄染毒组小鼠肝组织中MDA含量、SOD活力显著升高（P<0.05）,GSH-Px活力显著降低（P<0.05）。4.建立了测定小鼠肝组织和血浆中14种胆汁酸的UHPLC-MS/MS分析方法,并用于对照组和雄黄染毒组小鼠肝组织和血浆中胆汁酸的测定。在小鼠肝组织中检测到了11种胆汁酸,在小鼠血浆中检测到12种胆汁酸。5.在小鼠血浆和肝组织中三类胆汁酸的百分比都是牛磺结合型胆汁酸>游离型>甘氨结合型。雄黄暴露后小鼠肝组织中游离胆汁酸占比出现增加的趋势,牛磺结合胆汁酸占比出现降低的趋势;与肝组织相反,雄黄暴露后小鼠血浆中牛磺结合胆汁酸占比出现升高的趋势,游离胆汁酸占比出现降低的趋势,甘氨结合型胆汁酸占比也出现降低的趋势。6.与对照组比较,雄黄染毒组小鼠血浆中游离型胆汁酸与甘氨结合型胆汁酸之间的比值、游离型胆汁酸与牛磺结合型胆汁酸之间的比值均升高;在肝组织中,游离型胆汁酸与牛磺结合型胆汁酸之间的比值降低,初级胆汁酸和次级胆汁酸的比值降低。8.与对照组比较,鹅去氧胆酸（chenodeoxycholic acid,CDCA）、猪去氧胆酸（hyodeoxycholic acid,HDCA）、牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholic acid,TCDCA）和熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid,UDCA）在雄黄染毒组小鼠肝组织中显著升高（P<0.05）;甘氨脱氧胆酸（glycodeoxycholic acid,GDCA）在雄黄染毒组小鼠肝组织中显著降低（P<0.05）。脱氧胆酸（deoxycholic acid,DCA）、牛磺胆酸（taurocholic acid,TCA）、牛磺熊去氧胆酸（tauroursodeoxycholic acid,TUDCA）、TCDCA在高剂量雄黄染毒组小鼠血浆中显著升高（P<0.05）。雄黄暴露影响小鼠血浆和肝组织中胆汁酸之间的相关性,牛磺结合胆汁酸之间和游离胆汁酸之间相关性较好且呈正相关,甘氨结合型胆汁酸之间呈负相关。9.胆汁酸与氧化损伤指标的相关性分析发现雄黄染毒小鼠血浆中TCDCA与SOD呈正相关,在肝组织中TCDCA与GSH-Px呈负相关。随着雄黄染毒剂量的增加,血浆中甘氨结合型胆汁酸与氧化损伤指标的相关性增强。10.采用PLS-DA对小鼠胆汁酸代谢谱进行模式分析,结果发现雄黄暴露组与对照组小鼠血浆胆汁酸代谢谱的分离比肝脏胆汁酸代谢谱的分离明显。采用OPLS-DA、VIP和P值进行生物标志物筛选,发现血浆中的TCA、TCDCA和肝组织中的HDCA、TCDCA可以作为雄黄诱导肝损伤的潜在生物标志物。11.ROC曲线结果表明,肝组织中HDCA、TCDCA的AUC<0.3。血浆中TCA、TCDCA的AUC<0.1。12.与对照组比较,雄黄暴露组小鼠肝组织中Cyp7a1、Fxr、Bsep和Mrp2 m RNA表达升高,Ntcp m RNA显著降低。结论:1.雄黄中砷可在小鼠肝组织蓄积导致小鼠肝组织形态学变化、肝功能异常、肝组织氧化损伤。2.雄黄可引起小鼠胆汁酸谱发生变化,造成胆汁酸代谢异常。3.TCDCA为雄黄诱导小鼠肝损伤的敏感胆汁酸标志物。