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目的在周围神经损伤后的Wellerian溃变过程中存在大量的调节基因,Sppl即为关键调节基因之一,其在神经溃变远端的雪旺细胞(SCs)中表达显著上调。然而,在Wellerian溃变背景下SCs中特异性表达的Sppl,究竟如何发挥促进神经再生的作用以及相关的分子机制却并不清楚。因此,本研究在周围神经损伤模型中,分别从细胞和分子水平研究Sppl在Wellerian溃变过程中的表达和作用,并通过Sppl与神经轴突再生核心细胞——SCs的生物学关系研究其在神经轴突再生过程中的作用以及相关的信号转导通路,从而明确Sppl在周围神经变性与再生中的作用及分子调控机制。材料与方法1.利用成年雄性SD大鼠的坐骨神经横断损伤模型,在损伤远端神经组织中,通过组织免疫荧光(IHC)技术确定Sppl的表达定位,并观察神经组织损伤后不同时间点的Sppl动态表达变化;2.取新生SD大鼠的坐骨神经进行原代雪旺细胞培养,通过细胞免疫荧光(ICC)技术进一步明确Sppl在SCs中的表达定位情况;3.选用原代培养的雪旺细胞,分别应用Sppl-siRNA和pcDNA3.1(+)-Sppl转染细胞来沉默表达和过表达Sppl,然后分别通过EdU试验来检测SCs的增殖水平、Transwell试验来检测SCs的迁移能力以及Annexin V试验来检测SCs的凋亡情况,进而明确Sppl表达改变对SCs生物学功能的影响;4.继续利用原代培养的雪旺细胞,通过转染SCs沉默表达和过表达Sppl后,分别对影响SCs生物学活性的相关因子PKCα、Bax、Bcl2和Nf2进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术和蛋白印迹(Western Blot)技术检测,来进一步明确与SCs增殖、迁移及凋亡相关的基因和蛋白表达变化和Sppl表达改变之间的相互联系;5.体内实验:利用成年SD大鼠坐骨神经缺损的动物模型,植入携带Sppl-siRNA转染试剂的神经导管来桥接修复神经缺损,分别在术后 7 天和 14 天对 c-Fos、PKCα、ERK 进行 Real-time PCR 和 Western Blot的基因和蛋白检测,进一步探讨Sppl与p-ERK/ERK信号通路相关蛋白的关系,以明确Sppl在周围神经损伤后再生过程中的分子调控机制。结果1.在神经组织中,Sppl与SCs的特异性标志物S100共定位,并且在坐骨神经损伤后的6h到14d其表达逐渐升高;在SCs中Sppl与S100共定位,表明其在SCs中稳定表达。2.在体外的细胞学实验中,改变SCs中Sppl的表达可影响c-Fos、PKCα以及ERK的mRNA和蛋白表达水平,进而引发SCs生物学功能的改变。3.应用siRNA技术沉默Sppl表达后,抑制了 SCs的增殖但促进了 SCs的迁移和凋亡;而在转染Sppl过表达重组质粒后,SCs的增殖得到促进而迁移和凋亡则受到抑制。4.Real-time PCR结果表明:SCs中,siRNA干扰Sppl表达后,Bax、Bcl2、Nf2和PKCα的mRNA表达水平下降;Sppl过表达后,上述因子的mRNA表达水平上升。而与之相反,Sppl干扰后NT3的mRNA表达上升;Sppl过表达后其表达下降。5.在体内实验中,坐骨神经损伤后Sppl的差异表达也可通过c-Fos、PKCα等信号转导分子来调控p-ERK/ERK信号通路,进而影响神经损伤后的再生过程。结论1.在大鼠坐骨神经损伤后的华勒氏变性过程中,Sppl存在着差异表达。2.Sppl表达改变影响了 SCs的生物学功能:促进了体外培养SCs的增殖,并抑制其发生迁移和凋亡。3.Sppl可能通过维持Bc12和Bax的相对稳定性,阻止SCs的凋亡。4.Sppl是大鼠坐骨神经损伤后关键的调控因子,并通过c-Fos、PKCα等信号转导分子以及p-ERK/ERK通路影响神经溃变及再生。