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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种最常见的神经退行性疾病,tau蛋白异常过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)是其主要病理特征之一,在AD的发病中起举足轻重的作用。定位于内质网膜上的泛素连接酶Hrd1能够通过泛素-蛋白酶体通路介导多种异常聚集蛋白质的降解。我们的前期研究发现Hrd1和tau蛋白在神经细胞中存在着广泛的共定位,据此我们推测Hrd1可能会介导过度磷酸化tau蛋白的降解。本研究通过在神经细胞中过度表达或沉默内源性Hrd1的表达,观察神经细胞中过度磷酸化tau蛋白的水平变化,以了解Hrd1是否影响磷酸化tau蛋白的降解。目的:观察Hrd1是否可以促进神经细胞中过度磷酸化tau蛋白的降解,并了解生理性的Hrd1是否对神经元有保护。方法:通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和蛋白质片段互补实验(Protein Complementation Assay,PCA)证明Hrd1和tau蛋白之间存在相互作用;在N2A细胞中过表达Hrd1和tau蛋白,观察Hrd1是否促进tau蛋白的降解;将GSK-3β转染神经细胞及用OA诱导tau过度磷酸化,观察Hrd1是否促进磷酸化tau蛋白的降解;用siRNA沉默内源性Hrd1的表达,观察细胞过度磷酸化tau蛋白的聚集情况,同时观察内源性Hrd1是否对神经细胞有保护作用。结果:1.Hrd1与tau蛋白之间相互作用1.1免疫共沉淀在293T细胞中共转染tau质粒和Hrd1-his/myc(野生型),Hrd1C1A-his/myc(功能失活型)或Vector,转染24 hrs后提取细胞裂解上清液,用Protein A beads和anti-myc抗体免疫沉淀Hrd1,IB检测免疫沉淀物发现Hrd1-his/myc和Hrd1C1A-his/myc组均有tau蛋白存在,证明Hrd1和tau蛋白存在着相互结合作用,且为RING finger domain功能非依赖性。1.2蛋白质互补实验构建含荧光素酶(Luciferase)报告基因的Hrd1和tau的真核表达质粒,共转染293T细胞24 hrs后提取细胞裂解上清液,检测荧光素酶活性。Hrd1-hGluc(1)+hGluc(2)-tau组显示出极强的荧光素酶活性,说明Hrd1和tau蛋白在293T细胞浆中结合,使报告基因荧光素酶的两个劈裂单元结合,产生催化荧光素底物的活性。2. Hrd1促进N2A细胞中外源性过度表达的tau蛋白的降解在N2A细胞中过度表达Hrd1、Hrd1C1A、Vector和tau,另设一组平行转染GSK-3β诱导tau蛋白发生过度磷酸化,观察各组中tau蛋白水平。发现Hrd1能够明显促进外源性过表达tau蛋白的降解,且此功能为RING finger domain功能依赖性的。3. Hrd1促进OA诱导的N2A细胞中内源性过度磷酸化的tau蛋白降解在N2A细胞中分别转染Hrd1、Hrd1C1A和Vector,再以OA诱导其内源性tau蛋白过度磷酸化,用AT-8单克隆抗体检测磷酸化tau蛋白,发现Hrd1组,OA诱导的磷酸化tau蛋白水平比Hrd1C1A和Vector组明显减少。4. Hrd1加快N2A细胞中过表达外源性tau蛋白的降解速率在N2A细胞中分别转染Hrd1、Hrd1C1A、Vector和tau,转染24 hrs后加入放线菌酮(CHX)抑制蛋白质的合成,分别于0,8,16 h收取细胞,观察tau蛋白水平的下降速率。发现Hrd1组tau蛋白降解速率明显加快。5. Hrd1 knockdown并验证应用RNAi技术对N2A细胞中进行Hrd1knockdown,转染siRNA后24 hrs提取总RNA进行RT-PCR,同时留取Trizol裂解液蛋白相提取蛋白检测蛋白质水平变化。结果显示第3条siRNA沉默有效,同时检测蛋白质水平也有下降,遂选取此条siRNA进行后续实验。6. Hrd1 knockdown抑制OA诱导的内源性过度磷酸化tau蛋白的降解速率应用验证有效的siRNA转染N2A细胞24hrs以后,加入OA处理,再给予CHX,观察Hrd1 knockdown以后,内源性过度磷酸化tau蛋白下降速率的变化情况,结果发现siRNA组高度磷酸化tau蛋白水平维持稳定,且随着时间延长,有高分子量的聚集体出现,这与阿尔茨海默病发病机制中tau蛋白过度磷酸化后易于形成神经原纤维缠结相一致。7.原代胎鼠皮层神经元培养及染色鉴定取孕18 d胎鼠皮层组织消化后,吹打制成单细胞悬液接种到24孔板,培养液为含10 nmol·L-1阿糖胞苷的Neurobasal Medium(临用时1:50加入B27),每3 d换液一次,至第9 d进行免疫荧光染色鉴定,结果显示,胎鼠皮层神经元培养成功,纯度较高。8. Hrd1 knockdown导致OA处理的原代培养胎鼠皮层神经元轴突破坏加重对上述培养的原代胎鼠皮层神经元进行Hrd1 knockdown后,加入OA诱导tau蛋白过度磷酸化,对神经元进行形态学观察,与对照组比较发现,Hrd1 knockdown组神经元轴突结构破坏明显加剧,细胞死亡增多。结论:Hrd1能够与tau蛋白相互作用,从而介导神经细胞内过度磷酸化tau蛋白的降解,减轻其对神经细胞的毒性作用,这种作用是RING finger依赖的。