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第一部分蛛网膜下腔出血后大鼠脑组织中TRAF6的表达变化目的:探讨在蛛网膜下腔出血后TRAF6在大鼠脑组织中不同时间点的表达变化。方法:60只健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为5组,分别为假手术组,SAH-12h组,SAH-24h组,SAH-48h组,SAH-72h组,每组12只大鼠。于视交叉前池一次注入自体非肝素化动脉血0.3 ml建立SAH活体大鼠模型。所有的大鼠均在相应的时间点跨心脏灌注取脑,分别各取6只应用蛋白质印迹(west-blot)技术和免疫荧光染色分析脑组织中TRAF6的表达变化。结果:蛋白质印迹(west-blot)技术结果提示,蛛网膜下腔出血后,大鼠脑组织中TRAF6的表达水平呈先增高再下降的趋势,在出血后24h表达水平最高(P<0.05),免疫荧光染色技术得到同样的结果。结论:蛛网膜下腔出血后,TRAF6在大鼠脑组织中的表达水平呈先增高再下降的趋势,在出血后24h表达水平最高,提示TRAF6可能与SAH后的EBI有着某些联系,因此我们选择SAH后24h作为下一步实验的一个时间点。第二部分TRAF6在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及其作用机制的研究目的:通过TRAF6过表达质粒、小干扰RNA、基因定点突变技术等研究TRAF6在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中是否起作用及其可能作用机制。方法:实验1:108只健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为6组,分别为假手术组,SAH组,SAH+vehicle组,SAH+TRAF6 overexpression组,SAH+TRAF6control si RNA组,SAH+TRAF6 si RNA组,每组18只大鼠,分别各取6只应用蛋白质印迹(west-blot)技术分析脑组织中TRAF6、LC3 II/LC3 I的表达情况,根据脑组织中白蛋白(albumin)表达的变化来评价蛛网膜下腔出血后血脑屏障(blood–brain barrier,BBB)的通透性的变化;应用末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling TUNEL)与FLUORO-JADE B荧光染色测定神经细胞的凋亡及坏死比率;应用干湿法测定水肿指数,应用相关的试剂盒来测定新鲜脑组织中的氧化应激指标。实验2:108只健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为6组,每组18只,SAH+vehicle组,SAH+GFP-TRAF6-wt组,SAH+GFP-TRAF6-C70A组,SAH+TRAF6overexpression组,SAH+TRAF6 overexpression+MG132组,SAH+CLI-095组,分别各取6只应用蛋白质印迹(west-blot)技术分析脑组织中GFP-TRAF6-ub、ULK1-ub/ULK1-total、ECSIT-ub/mitochondria-pro、LC3 II/LC3 I的表达情况,根据脑组织中白蛋白(albumin)表达的变化来评价蛛网膜下腔出血后血脑屏障(blood–brain barrier,BBB)的通透性的变化;应用末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling TUNEL)与FLUORO-JADE B荧光染色测定神经细胞的凋亡及坏死比率;应用干湿法来测定水肿指数,应用相关的试剂盒来测定新鲜脑组织中的氧化应激指标。结果:实验1:TRAF6过表达质粒及小干扰RNA可分别显著提高和降低大鼠脑组织中TRAF6的表达水平(P<0.05,P<0.01)。分别降低和提高大鼠脑组织中自噬活性(P<0.05,P<0.05),分别提高和降低大鼠脑组织中神经元凋亡(P<0.05,P<0.05)和坏死细胞数目(P<0.01,P<0.01),分别提高和降低大鼠脑组织中ROS水平(P<0.05,P<0.05)、脑组织水含量(P<0.01,P<0.05)、白蛋白含量(P<0.01,P<0.05)。实验2:与GFP-TRAF6-wt组相比,GFP-TRAF6-C70A组中的TRAF6、ULK1、ECSIT的泛素化水平均未见增高(P<0.05);细胞自噬水平则明显增高(P<0.05);神经元凋亡和坏死细胞数目未见增加(P<0.05);ROS水平、脑水含量、白蛋白含量亦均未见增加(P<0.05)。此外,TRFA6的高表达可使ULK1的表达水平增高(P<0.01),MG132的应用可抑制ULK1的降解,同样增加ULK1的表达(P<0.05)。而TLR4抑制剂的应用则会使TRAF6的泛素化水平降低(P<0.01)。结论:TRAF6高表达可以抑制自噬和促进氧化应激反应,一定程度上加重SAH后的EBI,包括神经元凋亡/坏死数目增多、脑水肿加重、血脑屏障破坏等。TRAF6主要是依靠自身的E3泛素连接酶活性在SAH后的EBI中发挥作用的,并且TLR4作为TRAF6的一个上游分子,它的活性可以直接影响到TRAF6的表达及泛素化水平。