研究背景由动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)引起的心脑血管疾病严重危害着人类健康,在欧美一些国家已经成为危及人类健康的一号杀手,因此,对As发生发展机制的研究尤显重要。动脉粥样硬化的发病机理较为复杂,且至今尚不明确其发病机制。近年来研究发现,氧化应激(oxidative stress, OS)学说是As斑块形成学说中的重要组成部分,氧化应激与As的发病密切相关。巨噬细胞通过介导氧化应激参与心血管疾病的发生发展已成为研究热点。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-ademine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶是吞噬细胞(中性粒细胞、单核／巨噬细胞)产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要来源,包含胞膜成分细胞色素b558(gp91phox和p22phox,其中gp91phox有NADPH、heme、FAD的潜在结合位点)和胞浆成分p47phox、p67phox及小的GTP结合蛋白rac(单核细胞为rac1,嗜中性粒细胞为rac2)等五个亚组分。phox的晶体结构显示,p47phox的两个前后排列的Src同源区相互作用能抑制其与p22phox结合。当p47phox被磷酸化时这种抑制作用消失,胞质侧的亚组分易位到胞膜与细胞色素b558结合,且在rac的参与下激活NADPH氧化酶而启动呼吸链,爆发级联反应。单核／巨噬细胞在内皮细胞释放的趋化因子的作用下,积聚在血管内膜下,单核／巨噬细胞吞噬型NADPH氧化酶呼吸爆发生成的ROS在血管壁损伤,特别是斑块的形成、破裂与血栓形成中起着重要作用,动物实验研究中发现,在As损伤部位单核细胞／巨噬细胞NADPH氧化酶可能是生成O-2的重要源。在动脉粥样硬化斑块中超氧阴离子表达增加,并伴随着吞噬细胞gp91phox和p22phox表达增加及非吞噬细胞NOX4表达增加。在人冠状动脉粥样硬化斑块易受损的肩区显示gp91phox广泛表达,这与巨噬细胞定位相一致,以上结果提示,巨噬细胞氧化应激在动脉粥样硬化过程中起关键作用。大量的ROS,可使低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)发生氧化修饰,形成氧化低密度脂蛋白(oxidized LDL,Ox-LDL)。巨噬细胞对脂质的摄取也是通过受体途径,在巨噬细胞上有多种LDL的受体,每种受体对应着相应的配体。血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1 (lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1, LOX-1)是近年来首先在牛血管内皮细胞上发现的Ox-LDL受体,属SR型。它的结构不同于其他SR,为Ⅱ型膜表面糖蛋白,属于C型凝集素家族。进一步的研究发现巨噬细胞和血管平滑肌细胞(VSMCs)膜上亦有LOX-1表达,其基因序列同内皮细胞上的LOX-1完全相同,并且可识别和结合Ox-LDL,在动脉粥样硬化的早期能促进泡沫细胞的形成。研究发现,LOX-1结合Ox-LDL后可以迅速诱发内皮细胞ROS升高,特别是超氧阴离子和H2O2显著升高,升高的ROS除作为第二信使外,还直接作用于内皮细胞,使一氧化氮(NO)失活和核转录因子-κB(NF-κB)活化,胞膜脂质过氧化,巨噬细胞也有LOX-1表达,那么LOX-1在巨噬细胞氧化应激中是否起着重要的调节作用未见报道。综合以上的研究进展,我们提出一个假设：LOX-1在巨噬细胞氧化应激致动脉粥样硬化过程中可能起关键作用。基于国内外在本领域的研究进展,我们推测：Ox-LDL与LOX-1结合后可能诱导巨细胞NADPH的激活,进一步促进ROS生成,导致氧化应激,生成的ROS可作为第二信使,过多的ROS可通过增加钙离子水平来激活胞内信号通路和改变细胞内蛋白的氧化还原状态,使脂质氧化、黏附分子表达、基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases,MMP)激活、内皮细胞功能失调／凋亡、血管平滑肌细脆(VSMC)增殖和迁移以及血管收缩性改变,进一步放大氢化应激效应：造成恶性循环,加速动脉粥硬化的发展。目的我们将在国内外及时前期研究的基础上较为全面地分析LOX-1在巨噬细胞氧化应激致动脉粥样硬化这一重要病理过程中的作用。采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默LOX-1基因表达,观察LOX-1对巨噬细胞ROS生成及对NADPH氧化酶各组分基因表达的影响,结合流式细胞仪、Real-Time PCR、Western-blot等技术探讨Ox--LDL能否通过LOX-1来诱导巨噬细胞NADPH的激活,进一步促进ROS生成,导致氢化应激,同时选用丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路分析其作用机制。为进一步探讨LOX-1介导巨噬细胞氧化应激致动脉粥样硬化的作用,采用ApoE基因敲除小鼠,经尾静脉注射腺病毒Ad-siRNA-LOX-1,观察对动脉粥样硬化氧化应激的影响,进一步揭示LOX-1促进动脉粥样硬化的分子机制。本研究不仅可能发现Ox-LDL/LOX-1所诱导的氧化应激信号通路及其在动脉粥样硬化中的作用。还将可能提供新的药物治疗靶点,指导通过抑制LOX-1及其信号等新的抗动脉粥样硬化的临床治疗方案。方法1.LOX-1小分子干扰表达载体的构建根据siRNA的设计原则,设计、合成三对特异性针对LOX-1基因的小分子干扰RNA序列,同时设计与人类所有己知基因序列均无同源性的片段作为阴性对照,以LOX-1为靶基因设计并合成小发卡结构两端配对的siRNA寡核苷酸链,再经变性、复性后形成双链LOX-1-siRNA。采用DNA重组技术,将LOX-1基因双链与线性化pGenesiI-1质粒表达载体连接,用酶切法及测序法鉴定重组质粒。2.质粒LOX-1-siRNA转染小鼠巨噬细胞条件的优化及效应(1)培养小鼠巨噬细胞(RAW264.7),倒置相差显微镜观察细胞形态,将融合60%的巨噬细胞无血清培养24h后,细胞生长至对数增殖期。弃去原培养液,更换新的无血清培养液并随机分成2组(1×107个/组)：无血清对照组及转染组。分为质粒／脂质体转染试剂不同体积比(质粒量分别为0.5μg、1μg及1.5μg,体积比为1：1；1：2；1：3；作用48h。荧光显微镜下观察转染细胞绿色荧光的表达,流式细胞仪检测转染效率,MTT法测定细胞活性。(2)选用上述优化选择的转染条件,转染巨噬细胞,荧光定量PCR法检测LOX-1mRNA的表达,Western blot法检测LOX-1蛋白的表达,选择沉默效果最佳的作为下一步的干预序列。3.LOX-1对Ox-LDL所诱导巨噬细胞氧化应激的影响(1)实验分组：实验分成4组：对照组；Ox-LDL (50 mg/L)组；LOX-1-siRNA+Ox-LDL (50mg/L)；选用沉默效果最佳的干扰序列干预24h后再加入Ox-LDL作用16小时；pCon组：质粒对照组。(2)LOX-1对巨噬细胞MDA及SOD含量的影响：实验终止时,收取细胞,按照试剂盒说明书,分别对各组MDA及SOD含量进行测定。(3)荧光显微镜及流式细胞术法检测细胞内ROS水平：实验分为：阴性对照组；正常培养的细胞中不加荧光探针；正常对照组：正常培养的细胞中加入荧光探针,不加任何干预因素；H2O2阳性对照组：使用H2O2作为阳性对照组；Ox-LDL诱导组；加入Ox-LDL(50mg/L)作用16小时；LOX-1-siRNA+Ox-LDL组：LOX-1-siRNA干预24h后再加入Ox-LDL作用16小时;pCon组：质粒对照组。实验结束后采用荧光显微镜及流式细胞术法检测细胞内ROS的水平。(4)应用荧光定量PCR及Western blot法检测NADPH氧化酶核心酶及亚组分的表达,以GAPDH为内对照,检测NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox作为观察指标,荧光定量PCR方法及Western blot法检测NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox mRNA及蛋白表达。4.LOX-1在巨噬细胞氧化应激相关信号转导通路的作用(1) Ox-LDL作用不同时间对MAPKs信号转导通路的影响：观察Ox-LDL作用不同时间诱导MAPKs的作用,实验分为：无血清对照组及Ox-LDL (50 mg/L)作用不同时间组(Ox-LDL分别作用15min,30 min,60min,90min,120 min)。收集细胞,用Western-blot方法检测P-p38MAPK, p38 MAPK, P-ERK, ERK, P-JNK, JNK表达。(2)LOX-1-siRNA对Ox-LDL诱导巨噬细胞MAPKs信号转导通路的影响：观察LOX-1-siRNA对Ox-LDL诱导巨噬细胞MAPKs信号转导通路的影响,实验分为4组：对照组；Ox-LDL (50mg/L)组;LOX-1-siRNA+Ox-LDL (50 mg/L); pGenesil-1组。收集细胞,用Western-blot方法检测P-p38MAPK, p38 MAPK, P-ERK, ERK, P-JNK, JNK表达。5.LOX-1在ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化氧化应激的作用(1)采用APOE基因敲除(APOE KO)小鼠,高脂饮食饲养。8周龄ApoE-/-小鼠,高脂饮食饲养并随机分为下列3组(n=60)：APOE KO对照组；载体对照组；RNAi组。APOE KO对照组：于五周末经尾静脉注射PBS缓冲液(200μ1)至小鼠体内,隔14天重复注射PBS(200μ1)。观察4周,观察期间高脂喂养。载体对照组：于五周末将腺病毒Ad-siRNA-Neg(终滴度为5×1012 pful/mL)经尾静脉注射至小鼠体内,隔14天重复注射腺病毒Ad-siRNA-Neg,观察4周,观察期间高脂喂养。RNAi组：于5周末将腺病毒Ad-siRNA-LOX-1(终滴度为5×1012 pful/mL)经尾静脉注射至小鼠体内,隔14天重复注射腺病毒Ad-siRNA-LOX-1,观察4周,观察期间高脂喂养。(2)腺病毒介导的siRNA在体内的生物分布及差异表达：首次注射后第7天及第14天随机取小鼠5只,称其体重,按0.4ml/100g的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,迅速取出肝、肾及主动脉组织,立即送病理科行冰冻切片,厚度为5～8μm,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,评估Ad5-EGFP-LOX-1-sIRNA被组织吸收的情况。(3)检测主动脉中LOX-1 mRNA及蛋白的表达：尾静脉注射腺病毒Ad-siRNA-LOX-1观察4周后,用Real-time PCR及Western blot法检测主动脉中LOX-1 mRNA及蛋白的表达。(4)测定血脂水平：采用酶比色法,用全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三醋(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。(5) Movat五色套染法染色,使用Image Pro-Plus 5.1软件进行资料分析,观察不同组别斑块形态学变化,并测量平均斑块面积和斑块面积与管腔面积的比值。(6)采用Vevo 770 High-Resolution Imaging System (VisualSonics Inc., Toronto, Ontario, Canada)对小鼠进行左颈总动脉超声检查,测量左颈总动脉管腔直径、内膜中层厚度(IMT)。(7)免疫组化染色观察斑块内巨噬细胞CD68的阳性表达量,巨噬细胞CD68的阳性表达为胞浆内的棕黄色颗粒,实验结果经图像分析系统中的免疫组化模块处理。(8) Real-time PCR法及Western blot法及检测主动脉组织中LOX-1、NOX1、NOX2、racl、p47phox、p22phox mRNA及蛋白表达。结果1.LOX-1小分子干扰表达载体的构建成功构建了以LOX-1基因为靶点的真核表达载体LOX-1-siRNA1、LOX-1-siRNA2,经DNA测序和酶切鉴定,所构载体无基因突变,结果与预期符合,为下一步实验奠定了基础。2.质粒LOX-1-siRNA转染小鼠巨噬细胞条件的优化及效应(1)RAW264.7细胞在含10%的无酚红的DMEM培养基中生长良好。传代后2h贴壁,形态以类圆形和不规则多边形为主,一般含1～2个核,有伪足,细胞胞体较小,细胞生长快,5～6 d汇合。(2)经过优化转染条件,脂质体转染剂Lipofectamine2000可以将重组质粒LOX-1-siRNA高效转染入RAW264.7细胞,并保证较低的细胞毒性。两者最佳配比为LOX-1-siRNA1.0μg、Lipofectamine2000 2μl,转染入RAW264.7细胞后,能显著抑制LOX-1mRNA的表达,其中又以LOX-1-siRNA2抑制作用更强,作为我们下一步实验的最佳选择。3.LOX-1对Ox-LDL所诱导巨噬细胞氧化应激的影响(1)LOX-1对巨噬细胞MDA含量及培养液中SOD活性的影响：Ox-LDL组MDA的水平明显高于对照组(32.69±1.16 vs 9.79±1.52,P<0.05),而Ox-LDL组SOD水平却明显低于对照组(24.09±1.58 vs 13.08±1.08,P<0.05),表明经Ox-LDL诱导的巨噬细胞氧化系统和抗氧化系统己失去平衡,处于氧化应激状态。与Ox-LDL组相比,Ox-LDL+LOX-1-siRNA组细胞内MDA含量明显下降(32.6±1.16 vsl2.75±1.93,P<0.05),SOD活性明显升高(13.08±1.08VS 19.9±1.12,P<0.05)。(2)荧光显微镜观察LOX-1对巨噬细胞内ROS水平的影响：结果发现,Ox-LDL刺激后细胞内ROS水平较对照组明显升高,LOX-1-siRNA+Ox-LDL组,细胞内ROS水平明显下降。(3)流式细胞术检测细胞内ROS水平：结果显示,阳性对照组ROS平均荧光强度为(110.0±2.1),对照组为(33.8±2.8), Ox-LDL处理16h后ROS平均荧光强度(70.9±3.1)与对照组比较显著增加(P<0.05),而转染LOX-1-siRNA 24 h后再加Ox-LDL处理16h,巨噬细胞中ROS平均荧光强度为(38.7±2.3),与Ox-LDL组比较显著降低(P<0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。(4) Real-Time-PCR结果分析显示：Ox-LDL (50mg/L)诱导16h后,NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox mRNA表达水平明显上调,与对照组0.387±0.02相比差异具有统计学意义(P<0.05)。转染LOX-1-siRNA干预24h后再加入Ox-LDL刺激16h, NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox mRNA表达水平明显下调,与Ox-LDL差异具有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果显示：LOX-1-siRNA对巨噬细胞NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox蛋白表达水平的影响与基因水平趋势一致(P<0.05)。4.LOX-1在巨噬细胞氧化应激相关信号转导通路的作用(1)与对照组相比,Ox-LDL作用15 min时p38MAPK、JNK磷酸化水平显著增加(P<0.05),而后逐渐下降；Ox-LDL作用60 min时ERK1／2磷酸化水平显著增加(P<0.05),而后逐渐下降。(2)转染LOX-1-siRNA干预24h后再加入Ox-LDL刺激15min p38MAPK、JNK磷酸化表达水平明显下调,与Ox-LDL组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),转染LOX-1-siRNA干预48h后再加入Ox-LDL刺激60min ERK1/2磷酸化表达水平明显下调,与Ox-LDL组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。5.LOX-1在ApoE基因敲除鼠动脉粥样硬化氧化应激的作用(1)体重变化及血脂水平：各组小鼠在实验结束时体重均有一定的增加,但体重增加值在各组间无统计学差异(P>0.05)。在Ad-siRNA-LOX-1组中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇均有降低的趋势,但没有统计学差异(P>0.05)。(2)腺病毒介导的siRNA在体内的生物分布及差异表达：取干预组小鼠主动脉、肝脏、肾脏组织后立即作冰冻切片,在荧光显微镜下观察荧光表达情况。结果显示：主动脉、肝脏、肾脏组织都可见大量绿色荧光表达,并且在主动脉斑块内大量分布。(3) Real-time PCR及Western blot法检测主动脉中LOX-1 mRNA及蛋白的表达：Real-time结果显示：ApoE KO鼠对照组、病毒对照组主动脉LOX-1 mRNA表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05); Western blot结果显示：ApoE KO鼠对照组,病毒对照组主动脉LOX-1蛋白表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05),与RT-PCR结果一致,说明ApoE KO鼠经尾静脉注射Ad5-EGFP-LOX-1-siRNA后,LOX-1表达明显降低。(4) LOX-1-siRNA对主动脉粥样斑块面积的影响：Movat染色显示与对照相及对照载体组比较,RNAi干扰组ApoE-/-小鼠斑块面积,外弹力膜面积,斑块面积／血管面积减少但差异均无统计学意义(P>0.05),与对照相及对照载体组比较,RNAi干扰组ApoE-/-小鼠纤维帽显著增加(5.41±0.46 vs 4.78±0.25及4.81±0.34,P<0.05)。(5)左颈总动脉(LCCA)超声结果：左颈总动脉超声显示,各组平均动脉内径之间无显著性差异,与ApoE-/-安慰剂组及载体对照组相比,Ad-siRNA-LOX-1组左颈总动脉平均内膜中层厚度(IMT)明显降低,并具有统计学意义(0.29±0.06 vs 0.28±0.02,0.2±0.01,P<0.05)(6)主动脉斑块处巨噬细胞聚集：与ApoE安慰剂组及载体对照组相比,RNAi组斑块中巨噬细胞阳性率显著减少。Real-time PCR法检测组织中NOX1、NOX2、p22phox、p47phox、rac1mRNA表达(7) Real-time PCR及Western blot法检测组织中NOX1、NOX2、p22phox、p47phox raclmRNA表达：Real-time结果显示：ApoE KO鼠对照组,病毒对照组的NOX1、NOX2、p22phox、p47phox、rac1mRNA表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示：ApoE KO鼠对照组,病毒对照组的主动脉NOX1、NOX2、p22phox、p47phox、rac1蛋白表达均较LOX-1-siRNA组高,差异有统计学意义(P<0.05),与RT-PCR结果一致。结论1.成功构建了LOX-1基因RNA干扰载体LOX-1siRNA,转染效率可确保实验的可靠性,且操作简单,并成功筛选出针对小鼠LOX-1基因沉默的特异性siRNA,为动物实验奠定基础。2. Ox-LDL能诱导巨噬细胞LOX-1表达增加,激活巨噬细胞NADPH氧化酶,使NOX1、NOX2、Rac1、p47phox、p22phox表达明显增加,进一步诱发ROS大量生成,导致氧化应激。3. Ox-LDL与LOX-1结合能引起机体内ROS的增加,ROS的增加可激活MAPKs信号激酶,ROS可能是诸多信号传导通路的共同环节。4. ApoE-/-小鼠体内试验表明,LOX-1可能通过调节斑块的稳定性参与动脉粥样硬化的进程,而LOX-1调节斑块的稳定性可能与NADPH氧化酶的激活、ROS的生成有关。VI