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本研究通过采用T-A克隆技术构建出猪CYPlAl、2A19、2D25、2El、3A29和β-actin基因的重组质粒作为定量标准品,建立一套适合于研究猪CYPs mRNA表达水平的实时荧光定量方法,并以猪体内最为重要的药物代谢关键酶基因CYP3A29为基础,以商品猪-荣昌猪为对照,对4-6月龄的巴马香猪、贵州小型猪肝脏表达水平进行定量,初步筛选与人肝CYP3A4 mRNA水平接近的实验用小型猪品系。然后进一步对该品系小型猪初生、断奶、性成熟、体成熟以及2周年的肝脏表达水平进行定量,筛选到该品系猪与人肝CYP3A4 mRNA水平接近年龄段。最后,对筛选到的特定小型猪CYPIA1、2A19、2D25、2El、3A29 mRNA表达的组织分布、以及人CYP3A4的典型诱导剂-利福平对其肝脏CYP3A29 mRNA表达的诱导作用进行研究,并将结果与报道的人CYPsmRNA对应情况进行比较,获得的主要结果如下:
1.建立了适用于定量猪CYPs mRNA表达水平的TaqMan方法。PCR反应总体积为10μL,各成分终浓度为:Buffer,1 ×;Mg2+,5.5 mmol/L;dNTP mix,0.8 mmol/L:上、下游引物,各0.3 × mol/L;rTaq,0.2 U/× L;探针0.1 × mol/L;模板,1 × L。PCR热循环条件为94℃5 min→40 cycles(94℃15 s→60℃45 s→读板)。所建立的TaqMan方法定量范围较广、扩增效率较高、重复性较好。
2.4-6月龄巴马香猪、贵州小型猪、荣昌猪肝脏CYP3A29 mRNA平均表达水平分别为35.36±14.69、21.48±11.87和38.87±20.11,与人肝对应酶CYP3A4水平接近。从转录水平表明,以上3种猪均可用作人CYP 3A4所代谢药物的安全性评价实验模型。
3.巴马香猪CYP3A29 mRNA主要在肝脏中表达,其水平在初生到断奶、断奶到性成熟阶段均有显著增加,至性成熟及体成熟时其值分别为16.7243908±8.17834582和29.76705722±18.73595974,与人肝CYP3A4水平接近。从转录水平表明,性成熟及体成熟巴马香猪均可用作人CYP 3A4所代谢药物的安全性评价动物模型。
4.体成熟巴马香猪CYPIAI、2A19、2D25、2El mRNA水平均以肝脏最高,其值分别为13.24145753±9.166365249、134.5902182±68.02425634、33.43790049±43.12612521和162.783024±208.8879079,均与人肝对应酶CYPlA2、2A6、2D6、2El水平差异较大。从转录水平表明,体成熟巴马香猪不是人CYP1A2、2A6、2D6以及2El所代谢药物安全性评价的理想实验模型。
5.利福平能够显著增加体成熟巴马香猪肝脏CYP3A29 mRNA的表达,其水平提高了7.71倍,而对CYPlAl、2A19、2D25、2El mRNA表达无影响。从诱导的层次表明,体成熟巴马香猪可用作人CYP 3A4所代谢药物的安全性评价动物模型。