【摘 要】
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目的:探讨骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞的增殖及MTDH(Metadherin)介导的自噬在顺铂化疗敏感性中的作用,进一步研究microRNA-22对其调控的作用机制,为骨肉瘤的靶向治疗提供新的思路。方法:通过体外培养骨肉瘤细胞系MG-63进行实验研究,将培养所得细胞分成ctrl组,NC组,cisplatin组,cisplatin+miR-22组。利用MTT检测法和细胞克隆实验分别在
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目的:探讨骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞的增殖及MTDH(Metadherin)介导的自噬在顺铂化疗敏感性中的作用,进一步研究microRNA-22对其调控的作用机制,为骨肉瘤的靶向治疗提供新的思路。方法:通过体外培养骨肉瘤细胞系MG-63进行实验研究,将培养所得细胞分成ctrl组,NC组,cisplatin组,cisplatin+miR-22组。利用MTT检测法和细胞克隆实验分别在6,12,24h检测MG-63细胞增殖的变化,运用MDC染色检测MG-63细胞自噬的程度,并且运用LC3流式检测实验检测自噬相关蛋白LC3表达的变化。利用透射电镜实验(TEM)检测cisplatin和miR-22联合处理对骨肉瘤细胞自噬的影响,定量PCR法检测Beclin1、LC3、ATG5、MTDH的mRNA表达变化,Western blotting定量检测Beclin1、LC3、ATG5、MTDH的蛋白表达。L uciferase assay(荧光素酶)检测自噬基因MTDH是否为miR-22的直接靶点,Western blotting和定量PCR检测miR-22过表达和干扰时,MTDH表达变化。结果:(1)MTT法结果表明cisplatin可抑制MG-63细胞增殖(0.723±0.017),而加入miR-22协同cisplatin抑制MG-63细胞增殖的更加明显(0.515±0.012)。并且随着时间的延长,cisplatin+miR-22组中MG-63细胞的增殖能力也在逐渐下降。细胞克隆实验显示相比ctrl组(174.7±19.85)和NC组(186.7±5.033),cisplat in组中MG-63细胞的克隆能力在下降(129.7±4.163),当miR-22转染进MG-63细胞时,MG-63细胞克隆能力进一步降低(101.0±10.58)。(2)MDC染色结果表明顺铂可促进MG-63细胞自噬的表达,而miR-22可抑制顺铂引起的细胞自噬。LC3流式检测实验显示与对照组相比(5.673±0.145),顺铂可促进MG-63细胞自噬相关蛋白LC3的表达(15.23±0.153),而miR-22可抑制MG-63细胞中由顺铂引起的LC3表达升高(12.56±0.306,P<0.05)。TEM结果显示每组细胞中均有自噬溶酶体的存在,随着时间的延长,自噬小体慢慢产生,且cisplatin+mi R-22共处理组自噬比cisplatin单独处理的组有所减少。(3)Western blotting和定量PCR检测结果表明在MG-63细胞中,顺铂可促进MG-63细胞自噬相关基因Beclin1、MAP1LC3、ATG5、MTDH的表达,miR-22过表达可抑制MG-63细胞中自噬相关基因表达。(4)Luciferase assay显示miR-22同MTDH 3’-U TR有两个结合位点。在MG-63细胞中,miR-22过表达抑制MTDH表达,而miR-22表达下调时,MTDH表达上调。结论:自噬及增殖与骨肉瘤的顺铂化疗敏感性相关,miRNA-22通过调控自噬相关基因,进一步抑制自噬,从而增加顺铂化疗敏感性,进一步抵抗骨肉瘤顺铂化疗的耐药性。这些发现表明miR-22/MTDH/自噬调控通路在骨肉瘤化疗耐药性中起着关键作用。
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