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背景与目的甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma,PTC)是由甲状腺滤泡上皮细胞发展而来的最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一。近年来其发病率增长迅速,2018年国家癌症中心发布报告指出在女性群体中甲状腺癌发病率已上升至第四位。甲状腺癌可分为乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌及未分化癌四种病理类型,其中乳头状癌发病率最高,约占甲状腺癌的85%。虽然分化型甲状腺癌预后较好,死亡率仅为0.44%/10万,但鉴于其较高的发病率及早期淋巴结转移倾向,依然对广大人民群众造成很大的负担,文献表明约有80%的PTC患者存在淋巴结转移。因此,探究甲状腺乳头状癌的发病机制对其早期诊断及治疗具有重要意义。DNA甲基化是表观遗传学的经典调控机制之一,它的异常表现与多种疾病的发生发展密切相关。近年来,DNA羟甲基化的研究逐渐成为表观遗传学的热点问题之一,多项研究表明5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)在基因表达的转录调控及染色体重编当中起着重要的作用,并被证实对人类某些特定肿瘤的发生有重要的调控作用,可作为肿瘤早期诊断的生物标记物。此外,DNA整体水平的5-羟甲基胞嘧啶下调已在一些人类实体肿瘤中被检测到,且被证明与TET蛋白(Ten-eleven translocation,TET)密切相关,这种蛋白酶可以通过氧化作用将5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶从而参与到DNA羟甲基化的过程中。但是截止目前,仍没有关于甲状腺乳头状癌全基因组DNA羟甲基化的研究。因此,本课题旨在通过探究5-hmC及5-mC在甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中的表达情况,探究其与甲状腺乳头状癌患者的临床病理特征之间的相关性,同时分析TET蛋白家族在PTC患者中的表达情况及生物学作用。本研究首次证实5-hmC在甲状腺乳头状癌组织中呈下调趋势,且TET1的下降是PTC患者的不良预后因素。这一发现表明,TET1可能通过介导5-hmC的表达水平进而在甲状腺乳头状癌的发生发展中起关键作用。方法1、2018年1月至2018年5月期间于郑州大学第一附属医院甲状腺外科收集24例甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织,置于液氮中保存。2、运用硅胶柱纯化法及Trizol法提取癌组织及癌旁组织中的DNA和RNA,通过超微量分光光度计检测其浓度及其在260nm、280nm处的吸光值。3、通过qRT-PCR方法检测甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中TET1-3的表达水平,并分析其表达水平与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征间的相关性。4、通过ELISA方法检测甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织全基因组DNA水平5-mC的表达差异。5、通过ELISA方法检测甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织全基因组DNA水平5-hmC的表达差异。6、通过统计学软件SPSS 22.0分析TET1-3的表达水平与5-mC及5-hmC表达水平间的相关性。7、根据TET1的表达水平,将甲状腺乳头状癌患者分为高表达组和低表达组,通过统计学软件SPSS 22.0分析TET1的表达水平与患者临床病理特征间的相关性。结果1、ELISA结果显示在甲状腺乳头状癌组织中,5-mC的表达水平明显低于癌旁组织(癌旁:3.45%,PTC:1.38%,p=0.001);5-hmC的表达水平也显著降低(癌旁:0.019%,PTC:0.011%,p=0.02)。2、qRT-PCR技术检测TET蛋白家族的mRNA表达水平发现在甲状腺乳头状癌组织中,TET1-3的含量均属下调趋势(TET1:P<0.01;TET2:P=0.04;TET3:P<0.01)。3、通过SPSS统计学软件分析5-hmC水平与TET1(r=0.42,p=0.043)存在轻度正相关,但与TET2(r=-0.23,p=0.277)及TET3(r=0.20,p=0.354)之间无相关性。5-mC水平与TET蛋白无相关性(TET1:r=0.35,p=0.096;TET2:r=0.001,p=0.995;TET3:r=0.12,p=0.379)。随后通过分析TET1水平与甲状腺乳头状癌临床病理特征间的相关性,结果表明甲状腺乳头状癌组织中TET1的下调与患者淋巴结转移(p=0.046)和TNM分期(p=0.002)相关。结论1、5-hmC是甲状腺乳头状癌的生物标记物,TET1通过介导PTC中5-hmC的表达进而促进甲状腺乳头状癌的发生、发展。2、在甲状腺乳头状癌患者中,TET1的表达水平与患者淋巴结转移及TNM分期相关,是患者的不良预后因素。3、5-hmC和TET1可作为甲状腺乳头状癌诊断及治疗的可行性靶点。