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目的探讨慢性丙型肝炎患者血清Th1/Th2细胞因子水平变化及其与干扰素疗效的关系。材料和方法一、材料1、研究对象应用干扰素联合利巴韦林治疗的慢性丙型肝炎患者30例,男15例,女15例,年龄34-66岁,平均年龄48.5±8.11岁。治疗疗程为48周。疗效判定:应答组:治疗结束时ALT正常,HCVRNA阴转,并持续半年以上;无应答组,治疗结束时ALT未恢复正常或HCVRNA持续阳性。正常对照组15例:标本来自中国医科大学附属盛京医院体检中心。2、试剂与仪器HCVRNA提取试剂:TRIZOL、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水等;测序产物纯化试剂:EDTA(PH8.0),NaAc(PH5.2),无水乙醇,70%乙醇,HiDiFormamide(甲酰胺)等;RT-PCR扩增反应试剂盒,PCR产物纯化试剂盒及PCR反应引物购自TaKaRa(大连)有限公司;细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40及IL-12p70检测试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司,IL-5购自上海森雄科技实业有限公司;PCR扩增仪:美国PE公司产品,型号PE2400;电泳仪,北京六一仪器厂;凝胶成像系统,SHIDZU公司;紫外分光光度计,型号UV-160A,USA;ABI3130全自动测序仪:ABI美国;XW-80A旋涡振荡器:上海青浦泸西仪器厂K10CD;干式恒温器:杭州蓝焰科技有限公司;低速自动平衡离心机:LD25-2A,北京医用离心机厂;台式高速离心机:上海医用分析仪器厂生产,型号TGL-16G;伯乐全自动酶标仪680,美国BIO-RAD公司;超低温冰箱,MDF-1155-1520C,日本三洋公司;细胞恒温培养箱,WJ-22C Maf.NO.W-1343,日本产。二、方法1、血清细胞因子检测采用ELISA法检测血清IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-12p40及IL-12p70,按试剂盒说明方法进行检测。2、HCV基因分型检测采用直接测序法,根据5’UTR核苷酸序列进行分型。血清中提取HCV RNA,逆转录成cDNA后,进行PCR扩增,扩增片断大小约为450bp。PCR产物纯化后由沈阳市传染病院中心实验室进行核苷酸序列测定。测序结果经NCBI网站核对序列,确定HCV基因型。3、HCVRNA载量检测采用特异性荧光探针PCR法,由中国医科大学附属盛京医院中心实验室常规检测。4、血清ALT检测由中国医科大学附属盛京医院中心实验室应用美国贝克曼公司生产的8200A全自动生化分析仪常规检测。5.统计学分析应用SPSS15.0软件进行统计学检验,所用方法包括:均数的比较、x~2检验和Biraviate相关性检验。P值＜0.05为显著性差异水平。结果1、干扰素治疗结果30例患者中,应答组14例,无应答组16例,干扰素治疗持续应答率46.7%。应答组和无应答组相比,年龄、性别、体重及血清HCVRNA载量均无显著差异,血清ALT水平明显高于无应答组。应用Peg干扰素者应答率为62.5%,普通干扰素为40.9%,两者无显著性差异。2、HCV基因型分布及不同基因型患者干扰素治疗的应答率基因型分布以1b型最多,占46.7%,其余依次为2a型20%、1a型13.3%、2b型10%、3a型6.7%和1c型3.3%。1b型应答率为35.7%,2a型为66.7%,但统计学比较无显著性差异。3、慢性丙型肝炎患者血清细胞因子水平的变化慢性丙型肝炎组血清IL-2水平明显低于健康对照组,IL-5和IL-12p40水平明显高于后者,其它细胞因子水平两组之间无显著差异。4、血清细胞因子水平与HCV基因型的关系HCV基因型1型患者血清IL-6含量明显高于2型患者,其它细胞因子水平无差异;而1型和3型以及2型和3型之间所有细胞因子水平均无显著性差异。各亚型之间比较发现:2a型患者血清IL-2含量明显低于2b型。5、血清细胞因子水平与ALT和HCVRNA载量的关系血清IL-6含量与血清ALT水平呈正相关,与RNA载量呈负相关,其余细胞因子水平与ALT和HCVRNA载量无显著性相关。6、血清细胞因子水平与干扰素疗效的关系干扰素治疗应答组和无应答组治疗前血清细胞因子水平均无显著性差异,应答组治疗结束时IFN-γ水平较治疗前明显升高,其它细胞因子水平无显著性差异。无应答组治疗前后所有血清细胞因子水平均无显著性差异。结论1、慢性丙型肝炎患者存在Th1/Th2细胞因子失衡,血清Th1细胞因子水平下降,Th2细胞因子水平升高可能与丙型肝炎慢性化有关。2、IL-6可能与肝脏炎症活动相关。3、HCV基因型1型患者血清IL-6水平高于2型,2a型IL-2水平低于2b型,检测的其它细胞因子水平与基因型无关。4、干扰素治疗前血清细胞因子水平与干扰素治疗效果无关,不能对疗效进行预测,干扰素诱导的Th1细胞优势反应与持续应答有关。